體外培育牛黃復方制劑對血吸蟲病家兔肝纖維化組織及門靜脈血管病變影響的實驗研究.pdf

1、研究目的 通過對血吸蟲病家兔肝纖維化組織及門靜脈壁病理形態(tài)學觀察，F(xiàn)N、LN、ERK1/2及C-fos表達的組織化學和分子生物學研究，初步探討體外培育牛黃復方制劑對實驗性血吸蟲病家兔肝纖維化門靜脈高壓癥的影響，觀察體外培育牛黃復方制劑(In-vitrocultivatedcalculusboviscompoundpreparation，ICCBco)對肝纖維化的治療作用，為進一步探討其抗肝纖維化作用機制及選擇有效治療肝纖維化藥物

2、。 材料與方法 1.實驗動物模型制備：選用成年雄性中國大耳白兔20只，體重1.5～2.2kg。隨機取6只作為健康對照組；其余14只家兔采用腹部皮膚敷貼法感染血吸蟲，籠養(yǎng)至40天時隨機分為兩組，模型對照組7只，ICCBco干預7只。其中ICCBco干預組加以ICCBco喂養(yǎng)，600mg/kg/d，一次喂服。 2.標本采集：家兔飼養(yǎng)至90d時，實驗家兔經(jīng)4％戊巴比妥鈉50mg/1kg，腹腔注射麻醉，采集標本，保存?zhèn)錂z

3、。 3.研究方法 (1)ICCBco肝組織及門靜脈壁病理形態(tài)學觀察：采用HE染色，三色膠原染色及透射電鏡觀察各組組織學、膠原含量及組織病理學變化。 (2)ICCBco肝組織及門靜脈壁Fibronectin及Laminin表達的研究：采用免疫組織化學方法對各組肝纖維化組織及門靜脈壁組織切片進行FN，LN染色，顯微圖像分析儀分析FN及LN含量。 (3)ICCBco對肝纖維化門脈高壓癥門靜脈壁ERK1/2及C-

4、fos表達的研究：采用Westernblot檢測各組冢兔門靜脈血管組織ERK1/2活性及免疫組織化學法檢測各組家兔門靜脈血管壁c-fos表達，探討ICCBco對血及蟲病肝纖維化門靜脈高壓癥血管病變的影響。 結果 1.病理學證實90d時模型組家兔肝表面呈灰褐色，組織變硬，被膜腫脹肝臟有大量肝臟表面密布灰色或灰黃色粟粒樣蟲卵結節(jié)，肝臟大量膠原沉積，符合肝硬化基本病理改變，肝纖維化造模成功。 2.ICCBco肝組織及門

5、靜脈壁病理形態(tài)學觀察： 肉眼觀察：模型組家兔肝表面呈灰褐色，組織變硬，被膜腫脹，肝臟表面密布灰色或灰黃色粟粒樣蟲卵結節(jié)，伴有的可見少量或中量腹水，脾臟腫大明顯，門靜脈及內(nèi)臟靜脈系統(tǒng)充血、擴張；ICCBCO治療組，肝臟色呈暗紅色，表面只見散在蟲卵結節(jié)，沒有腹水，脾腫大不明顯，門靜脈及內(nèi)臟靜脈充血擴張不明顯。 HE染色：模型對照組家兔肝臟匯管區(qū)有大量蟲卵肉芽腫形成，纖維組織增生明顯，以匯管區(qū)為中心逐漸向肝小葉延伸，肝竇壁增厚

6、，壓迫竇腔，并包饒肝細胞；大量膠原纖維形成條束狀纖維隔，重新分隔肝小葉；ICCBco干預組沒有出現(xiàn)明顯的纖維化和假小葉，肉芽腫較小且數(shù)目少；肝臟纖維結構存在，基本維持肝小葉結構，纖維成份局限于匯管區(qū)。 Pollak三色染色：ICCBco干預組：肝匯管區(qū)周圍肝細胞間膠原纖維較模型組明顯減少，門靜脈平滑肌細胞間門靜脈平滑肌細胞間見少量線狀膠原纖維，與模型組比較明顯減少。模型對照組肝組織及門靜脈膠原纖維含量與健康對照組比較有顯著差異性

7、，P＜0.01，ICCBco干預組肝組織及門靜脈膠原纖維含量明顯減少，與模型對照組比較有顯著差異性，P＜0.01。 透射電鏡結觀察：模型對照組肝竇內(nèi)皮受損嚴重，細胞大多崩解，竇內(nèi)可見肥大細胞，中性粒細胞、槳細胞及淋巴細胞浸潤，毛細膽管擴張，肝細胞肝竇面的微絨毛減少或斷裂，肝竇呈毛細血管化；肝細胞不同程度損傷，形態(tài)不規(guī)則，核染色質(zhì)聚積，顏色變淡，胞槳內(nèi)富含溶酶體及吞噬體，線粒體基質(zhì)呈絮狀變性，嵴消失或減少，內(nèi)織網(wǎng)擴張，粗面內(nèi)織網(wǎng)短

8、而少，糖元較豐富；ICCBco 干預組家兔肝細胞核結構正常，核周圍間隙清昕，粗面內(nèi)織網(wǎng)排隊列整齊。 3.ICCBco肝組織及門靜脈壁Fibronectin及Laminin表達的研究： 顯微圖像分析及統(tǒng)計結果：ICCBco治療組組FN表達(OD值)與模型對照組比較有顯著差異，P＜0.0001。ICCBco治療組肝組織及門靜脈壁C組LN表達(OD值)明顯減少，與模型對照組比較差異有顯著統(tǒng)計學意義，P＜0.01。

9、 4.ICCBco對肝纖維化門脈高壓癥門靜脈壁ERK1/2及C-fos表達的研究：門靜脈壁ERK1/2表達：血吸蟲病模型組門靜脈壁ERK1/2活性較正常對照明顯增高一倍以上(P＜0.01)。ICCBco干預組的ERK1/2活性較血吸蟲病模型組明顯降低。 門靜脈壁C-fos表達：ICCBco干預組與血吸蟲病家兔組門靜脈壁c-fos表達與模型對照組相比c-fos表達明顯減弱(P＜0.01)。 結論 1.通過病理形態(tài)

10、學觀察，說明ICCBco可以保護和阻抑血吸蟲病肝纖維化組織及門靜脈壁病理變化的形成進程，有抗血吸蟲病肝纖維化作用。 2.ICCBco能抑制肝組織及門靜脈壁Fibronectin及Laminin表達，降低細胞外基質(zhì)的沉積，發(fā)揮抗肝纖維化作用。 3.ICCBco干預組的ERK1/2活性較血吸蟲病模型組明顯降低。血吸蟲病組門靜脈壁pERK1/2光密度值較ICCBco干預組和正常對照組高2～3倍(P＜0.01)。說明ERKi/2