ICAM-1介導(dǎo)的脈沖電刺激下血管內(nèi)皮細(xì)胞與祖細(xì)胞粘附的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　 生物電是人體的固有屬性,伴隨著每個(gè)生命活動(dòng)的完成；細(xì)胞是機(jī)體基本組成單位,細(xì)胞膜內(nèi)外某些帶電離子分布和濃度不同以及細(xì)胞膜對(duì)不同離子的選擇通透性,正是細(xì)胞、組織形成跨膜電位的條件,也是生物電的起源。正常情況下,細(xì)胞間緊密連接的存在可使跨膜電位均等分布于相應(yīng)組織當(dāng)中,組織一旦損傷,完整的細(xì)胞間緊密連接不復(fù)存在,損傷處局部跨膜電位即被削弱,健側(cè)部位的高電勢(shì)和損傷病灶的低電勢(shì)隨即形成一內(nèi)生電場(chǎng)。由于內(nèi)生電場(chǎng)激活了

2、病變組織細(xì)胞及其周圍細(xì)胞修復(fù)信號(hào)的傳遞,可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生損傷修復(fù)效應(yīng),因此,如何深化認(rèn)識(shí)內(nèi)生電場(chǎng)修復(fù)作用并加以利用則顯得十分重要。
　　 基于此背景,生物電刺激在血管再生領(lǐng)域中的應(yīng)用已經(jīng)積累了一定的數(shù)據(jù),有關(guān)策略主要圍繞以下兩個(gè)方面:第一,外部施加生物電刺激直接促進(jìn)機(jī)體內(nèi)血管再生,相當(dāng)于彌補(bǔ)并強(qiáng)化內(nèi)生電場(chǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的修復(fù)效應(yīng)；第二,以構(gòu)建組織工程化血管為中心,通過生物電刺激的干預(yù),從排列、粘附和抗件等方面增強(qiáng)種子細(xì)胞與生物材料的整合

3、。由于血管內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋所有類型血管并密切接觸血流,同時(shí)也是新生血管形成的首要環(huán)節(jié),故目前電刺激研究多集中于血管內(nèi)皮細(xì)胞功能學(xué)的改變。然而,研究表明僅僅依賴于血管內(nèi)皮增殖或出芽等原位修復(fù)并不能滿足重建血管、改善血流的需要,內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelialprogenitor cell,EPC)的發(fā)生發(fā)展已被證實(shí)對(duì)成體血管再生有著不可替代的作用,新生血管形成的研究方向逐漸由傳統(tǒng)的血管形成過渡罕EPC介導(dǎo)的血管發(fā)生。那么EPC將如何參與到電

4、刺激促新生血管形成過程?該問題的探討十分有意義。
　　 隨著EPC探索的深入,EPC研究已由改良培養(yǎng)方法和分析增殖分化能力為主的策略演變?yōu)閷?duì)細(xì)胞歸巢信號(hào)的重點(diǎn)探索。EPC歸巢,指在缺血損傷的應(yīng)激代償反應(yīng)中,EPC因缺血部位趨化因子的誘導(dǎo)而產(chǎn)生動(dòng)員和定向遷移,然后在血管內(nèi)皮層上緩慢移動(dòng),繼而與血管內(nèi)皮產(chǎn)生緊密粘附并完成跨內(nèi)皮轉(zhuǎn)移,最后通過直接分化和分泌等形式來完成修復(fù)反應(yīng)。經(jīng)證實(shí),EPC與血管內(nèi)皮之間的粘附在整個(gè)歸巢過程當(dāng)中起著承

5、上啟下的作用,已知多對(duì)粘附分了組合參與此調(diào)節(jié)過程。其中細(xì)胞間粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule,ICAM-1)屬于免疫球蛋白超家族成員,其在血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的表達(dá)不僅介導(dǎo)了細(xì)胞間的粘附,更重要的是通過這種結(jié)合,可將外界損傷刺激信號(hào)沿著EPC膜上配體整合素αvβ2,尤其是整合素β2,傳遞至EPC胞內(nèi),然后啟動(dòng)后續(xù)生物學(xué)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo),在粘附分子調(diào)控的歸巢過程當(dāng)中最為關(guān)鍵。那么血管內(nèi)皮在適宜電刺激的調(diào)節(jié)

6、下能否增強(qiáng)自身與EPC的粘附?電刺激促進(jìn)血管內(nèi)皮捕獲循環(huán)EPC的機(jī)制又是否與ICAM-1的上調(diào)有關(guān)?國內(nèi)外未見同類型報(bào)道,這是開展木課題研究的主要目的。
　　 為驗(yàn)證我們的設(shè)想,本課題研究分為三個(gè)部分:
　　 (1)自主研制具有適合刺激形式的電刺激儀,獲得人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Humanumbilical vein endothelial cell,HUVEC)并建立細(xì)胞培養(yǎng)電刺激模型,首先評(píng)價(jià)電刺激下培養(yǎng)體系的穩(wěn)定性、HU

7、VEC形態(tài)學(xué)和增殖活性的改變；
　　 (2)誘導(dǎo)培養(yǎng)外周血EPC并進(jìn)行鑒定,通過熒光標(biāo)記EPC以衡量電刺激下HUVEC與EPC之間粘附強(qiáng)度的改變；
　　 (3)檢測(cè)電刺激下HUVEC ICAM-1的表達(dá)水平,以期探索電刺激影響HUVEC捕獲EPC的可能機(jī)制。
　　 方法
　　 (1)電刺激儀的研制與評(píng)價(jià)
　　 聯(lián)合生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院醫(yī)學(xué)工程系,自主研制脈沖輸出形式的電刺激儀；固定刺激脈寬和頻率為最大

8、值,伏安法檢測(cè)不同電壓幅度刺激下2h內(nèi)培養(yǎng)液電阻,并且探測(cè)局部溫度的變化；
　　 (2)電刺激對(duì)HUVEC形態(tài)學(xué)以及增殖活性的影響
　　 膠原酶消化法分離HUVEC,結(jié)合形態(tài)學(xué)和Ⅶ因子相關(guān)抗原對(duì)其鑒定；將HUVEC分為不同參數(shù)刺激組和常規(guī)培養(yǎng)組,刺激24h后觀察HUVEC形態(tài)學(xué)變化,MTS法比較HUVEC增殖活性的差異；
　　 (3)電刺激對(duì)HUVEC與EPC之間粘附強(qiáng)度的影響
　　 密度梯度離心法分離外

9、周血單個(gè)核細(xì)胞,專用培養(yǎng)基直接誘導(dǎo)培養(yǎng)外周血EPC,于第9天進(jìn)行免疫熒光鑒定(乙?；兔芏戎鞍缀颓G豆類凝集素)以及表面標(biāo)志流式分析(CD34、CD133、CD31、VEGFR2和CD14)；
　　 取第9天EPC,活性熒光染料CFSE標(biāo)記后接種在單層HUVEC上,不同參數(shù)電刺激培養(yǎng)24h,顯微鏡下觀察貼壁熒光標(biāo)記EPC數(shù)量,熒光酶標(biāo)儀讀取細(xì)胞熒光強(qiáng)度,以熒光比率衡量粘附強(qiáng)度。
　　 (4)電刺激對(duì)HUVEC ICAM-

10、1表達(dá)的影響
　　 24h培養(yǎng)結(jié)束后分別收集不同參數(shù)電刺激組和常規(guī)培養(yǎng)組細(xì)胞的總RNA,采用Real time PCR技術(shù)中的SYBR Green染料法,運(yùn)用2-△△Ct法對(duì)各實(shí)驗(yàn)組中HUVEC ICAM-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。
　　 (5)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:
　　 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,表面標(biāo)志陽性率比較采用配對(duì)t檢驗(yàn),多組間不同時(shí)間點(diǎn)電阻比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析,多組間溫度比較、熒光

11、比率比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方差分析,多組間細(xì)胞增殖活性比較、基因表達(dá)量比較采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的方差分析:方差齊時(shí)采用Fisher法,多重比較用Bonferroni法;方差不齊時(shí)則用Welch近似法,多重比較用Dunnett T3法,P<0.05視為具有顯著性差異,采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算。
　　 結(jié)論
　　 (1)成功研制出具有雙相脈沖輸出的電刺激儀,并且建立了相對(duì)穩(wěn)定的細(xì)胞培養(yǎng)刺激模型,在固定5V和5Hz的前提下,

12、HUVEC形態(tài)改變明顯,呈扁平長梭形伸展,但其增殖活性并不隨著刺激脈寬的延長(0、1、3、6、9ms)而改變;
　　 (2)成功從外周血單個(gè)核細(xì)胞中直接誘導(dǎo)培養(yǎng)出EPC,經(jīng)鑒定,細(xì)胞符合正在分化的早期EPC表型；
　　 (3)雙相脈沖電刺激在一定范圍內(nèi)有利于HUVEC與EPC之間的粘附,其中以5V/5Hz/6ms組粘附增強(qiáng)最為顯著；
　　 (4)雙相脈沖電刺激可上調(diào)HUVEC ICAM-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量,變

13、化規(guī)律與細(xì)胞間粘附實(shí)驗(yàn)一致,同樣以5V/5Hz/6ms作用最顯著,提示HUVEC ICAM-1表達(dá)上調(diào)可能是電刺激促進(jìn)HUVEC捕獲EPC的機(jī)制之一。
　　 創(chuàng)新點(diǎn)
　　 (1)前期研究中多采用直流電形式對(duì)HUVEC等血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),有關(guān)脈沖電刺激研究報(bào)道不多,本研究在國內(nèi)外較早采用正負(fù)雙相脈沖形式對(duì)HUVEC進(jìn)行干預(yù),為電刺激下血管再生的體外研究提供新的實(shí)驗(yàn)方法。
　　 (2)本研究首次將內(nèi)皮祖細(xì)胞整合到