沉默TRPV1基因?qū)嗫ㄒ蛩录?xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制.pdf

1、目的：
　　構(gòu)建針對人TRPV1基因的pSUPERretro-puroTRPV1逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體，感染U87-MG細(xì)胞，觀測其沉默TRPV1基因的效果。通過沉默TRPV1基因觀測利多卡因處理后對U87-MG的細(xì)胞狀態(tài)和凋亡情況的影響，以探討利多卡因是否通過TRPV1產(chǎn)生神經(jīng)毒性損傷。
　　方法：
　　利用Ambion在線設(shè)計軟件設(shè)計針對人TRPV1基因的shRNA干擾序列，克隆到pSUPERretro-puro載體上

2、。對重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列測定和酶切分析。用磷酸鈣法制備pSUPERretro-puroTRPV1逆轉(zhuǎn)錄病毒，將其感染到U87-MG細(xì)胞，經(jīng)嘌呤酶素篩選陽性克隆后采用熒光定量PCR及Westernblotting法檢測TRPV1表達(dá)。U87-MG的細(xì)胞分為空白對照組、基因沉默組以及空載體組。對于每個組的細(xì)胞，我們利用流式細(xì)胞技術(shù)，研究利多卡因處理后不同時間點(diǎn)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及線粒體膜電位情況。并通過MTT方法和流式細(xì)胞術(shù)，檢測U87-

3、MG細(xì)胞的活力和凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　經(jīng)DNA測序和酶切鑒定表明，pSUPERretro-puroTRPV1表達(dá)載體構(gòu)建成功。pSUPERretro-puroTRPV1逆轉(zhuǎn)錄病毒感染U87-MG細(xì)胞后，細(xì)胞中TRPV1表達(dá)量明顯降低。U87-MG細(xì)胞活力隨著利多卡因處理濃度增高而降低。利多卡因處理各組細(xì)胞后隨著時間增加，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度逐漸上升。TRVP1基因沉默組的各時點(diǎn)鈣離子濃度顯著比其他各組低（P<0.05）。利

4、多卡因處理后，對照組U87-MG細(xì)胞的線粒體膜電位明顯下降，而在TRVP1基因沉默組線粒體膜電位較高（P<0.05）。同時，流式細(xì)胞結(jié)果顯示，利多卡因處理后，各組的細(xì)胞凋亡增高，而在TRVP1基因沉默組則明顯低于對照組（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　成功構(gòu)建了針對人TRPV1基因的pSUPERretro-puroTRPV1表達(dá)載體。pSUPERretro-puroTRPV1能有效下調(diào)TRPV1基因在U87-MG細(xì)胞中的表