依賴輸血的地中海貧血患兒PRA檢測(cè)及其干擾HSC植入的研究.pdf

1、本研究擬在依賴輸血β地中海貧血患兒中開展酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)PRA，探討依賴輸血地中海貧血患兒的體液致敏水平及其臨床意義。 第一章依賴輸血的地中海貧血患兒PRA檢測(cè)及臨床意義。 一、研究目的：采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)依賴輸血的β地中海貧血患兒的群體反應(yīng)性抗體(PRA)，探討依賴輸血地中海貧血患兒的體液致敏水平及其臨床意義。 二、研究對(duì)象和方法： 1.研究對(duì)象：2005年3月至12月

2、隨機(jī)選擇在我科臨床確診為β地中海貧血且有依賴輸血史(輸血次數(shù)≥3)的患兒共15例，其中男9例，女6例，年齡(6.15±4.01)歲(1歲～13歲)。β地中海貧血的診斷按實(shí)用兒科學(xué)第7版的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并常規(guī)作基因診斷和家系調(diào)查證實(shí)，入選的15例β地貧患兒經(jīng)基因診斷均為β0、β+基因純合子或雙重雜合子；按診斷標(biāo)準(zhǔn)，15例均為重型β地貧患兒。 2.實(shí)驗(yàn)方法： 2.1標(biāo)本的采集：所有入選者均抽取靜脈血3ml，離心分離血清，-20℃

3、保存待檢測(cè)。 2.2血清PRA的水平及特異性檢測(cè)：收集血清標(biāo)本后，采用美國(guó)OneLambda公司提供的萊姆德混合抗原板(LATM)和萊姆德抗原板(LAT)檢測(cè)PRA，檢測(cè)方法：依據(jù)ELISA原理，采用不同的HLA抗原包被泰薩奇(Terasaki)板，以特異性檢測(cè)抗HLAIgG抗體。其中LATM為Ⅰ類A、B、C抗原和Ⅱ類DR、DQ抗原混合，各組成2個(gè)試驗(yàn)孔，是定性檢測(cè)。LAT為Ⅰ類A、B、C抗原組成28個(gè)試驗(yàn)孔、Ⅱ類DR、DQ抗原

4、組成12個(gè)試驗(yàn)孔，是定性與定量分析。主要步驟包括：稀釋標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和待測(cè)血清，分別加入96孔Terasaki板，1小時(shí)后洗板，再加辣根過(guò)氧化物酶交聯(lián)的IgG二抗，40分鐘后洗板，加入底物避光顯色10分鐘終止，1小時(shí)內(nèi)測(cè)定各孔的吸光度值(A630nm)。儀器為可用于Terasaki板測(cè)定的BioTek800NB型酶標(biāo)儀。計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析Ⅰ類、Ⅱ類IgG抗體的水平和特異性。檢測(cè)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：以LATM板陰性(PRA＜10％)為無(wú)致敏，對(duì)LAT

5、M陽(yáng)性的患者行LAT板檢測(cè)，并根據(jù)藍(lán)色孔數(shù)目分為低度致敏(10％≤PRA＜50％)、中度致敏(50％≤PRA＜80％)和高度致敏(PRA≥80％)。 三、研究結(jié)果： 1.用酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)15例臨床確診為β地中海貧血且有依賴輸血史(輸血次數(shù)≥3)的患兒進(jìn)行PRA水平和特異性檢測(cè)，結(jié)果PRA陽(yáng)性病例6例，占檢測(cè)總數(shù)40％。PRA強(qiáng)度在14％～75％之間，中位PRA強(qiáng)度為47.5％；PRA陽(yáng)性組患兒年齡(8.67±3.95)

6、歲、接受輸血總時(shí)間(96.00±44.99)月分別高于PRA陰性組(4.47±3.24)歲、(40.33±35.14)月，差異有顯著性意義(P＜0.05)；PRA陽(yáng)性組輸血總次數(shù)(90.17±33.42)高于PRA陰性組(30.11±18.42)，差異有極顯著意義(P＜0.01)；兩組的開始輸血年齡比較，差異無(wú)顯著性意義(P＞0.05)。 2.男性地貧患兒與女性地貧患兒的PRA檢出率比較：男性地貧患兒的PRA陽(yáng)性檢出率為(2/9

7、，22.2％)，陰性檢出率為(7/9，77.8％)；女性地貧患兒的PRA陽(yáng)性檢出率為(4/6，66.7％)，陰性檢出率為(2/6，33.3％)；兩組的PRA檢出率比較，經(jīng)Fisher精確概率檢驗(yàn)(Fisher'sExactTest)，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.136＞0.05)。 3.從依賴輸血地貧患兒PRA水平與患兒年齡、開始輸血年齡、接受輸血總時(shí)間、輸血總次數(shù)之間的Spearman等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果中，可見PRA定性與輸血總

8、次數(shù)、患兒年齡、接受輸血總時(shí)間呈正相關(guān)(rs分別為0.819、0.536、0.567，P分別為＜0.01、＜0.05、＜0.05)；PRA強(qiáng)度與輸血總次數(shù)、患兒年齡、接受輸血總時(shí)間呈正相關(guān)(rs分別為0.830、0.598、0.622，P分別為＜0.01、＜0.05、＜0.05)；而兩者與開始輸血年齡無(wú)相關(guān)關(guān)系(P＞0.05)。 四、研究結(jié)論： 1.依賴輸血地貧患兒中的PRA陽(yáng)性檢出率(6/15、40％)。 2.

9、PRA陽(yáng)性組的地貧患兒與PRA陰性組比較，其平均年齡較大、平均接受輸血總時(shí)間較長(zhǎng)、平均輸血總次數(shù)較多。 3.經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果證實(shí)：輸血總次數(shù)越多、年齡越大、接受輸血總時(shí)間越長(zhǎng)的地貧患兒，其出現(xiàn)PRA強(qiáng)度高的機(jī)會(huì)越多。 第二章地中海貧血患兒血清特異性PRA影響臍血造血干細(xì)胞增殖、分化和凋亡、壞死特征的研究。 一、研究目的：擬在體外將臍血單個(gè)核細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)血清(健康兒童AB血型血清，不同水平的特異性P

10、RA血清)、補(bǔ)體聯(lián)合孵育后，通過(guò)體外臍血造血干/祖細(xì)胞半固體集落培養(yǎng)，探討不同水平的特異性PRA對(duì)臍血造血干/祖細(xì)胞增殖、分化能力的影響；應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)臍血造血干/祖細(xì)胞凋亡及壞死細(xì)胞百分率，探討不同水平的特異性PRA對(duì)臍血造血干/祖細(xì)胞凋亡及壞死特征的影響。 二、研究材料和方法： 1.標(biāo)本來(lái)源：臍血(cordblood，CB)來(lái)自本院健康足月妊娠剖宮分娩之胎兒臍靜脈血，用含肝素的無(wú)菌干燥瓶收集，采血量為80-100

11、ml，共5份。 2.實(shí)驗(yàn)方法： 2.1臍血的HLA分型在收集臍血標(biāo)本時(shí)，取出其中的2ml置于EDTA抗凝管中，并振蕩搖勻后送HLA-Ⅰ.Ⅱ類抗原分型檢測(cè)。HLA-Ⅰ類抗原檢測(cè)采用一步法單克隆抗體技術(shù)。HLA-Ⅱ類抗原檢測(cè)采用序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR-SSP)。由專人檢測(cè)并報(bào)結(jié)果。 2.2分離臍血單個(gè)核細(xì)胞采用Ficoll-Hapaque分離法。 2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)臍血MNC的CD+34細(xì)胞

12、百分率流式細(xì)胞儀檢測(cè)臍血MNC中的CD+34細(xì)胞，由專人負(fù)責(zé)并報(bào)結(jié)果。 2.4臍血MNC與實(shí)驗(yàn)血清、補(bǔ)體共孵育后半固體集落培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)分A～E組。A組：不加血清組(空白對(duì)照組、PRA0ul組)；B組：健康兒童AB血型血清組(正常對(duì)照組)；C組：PRA50ul組；D組：PRA100ul組；E組：血清補(bǔ)體均不加組(補(bǔ)體空白對(duì)照組)。 2.5臍血MNC與實(shí)驗(yàn)血清、補(bǔ)體共孵育后凋亡與壞死的觀察實(shí)驗(yàn)分組：A組：不加血清組(空白對(duì)照組、

13、PRA0ul組)；B組：健康兒童AB血型血清組(正常對(duì)照組)；C組：PRA500ul組；D組：PRA1000ul組。 三、研究結(jié)果： 1.臍血MNC的CD+34細(xì)胞含量5份臍血單個(gè)核細(xì)胞的CD+34細(xì)胞為(1.62±0.13)％ 2.PRA對(duì)臍血MNC集落的影響在半固體集落培養(yǎng)第7天，A、B、C與D組間兩兩集落形成情況的比較：A組和B組總集落數(shù)、CFU-GM分別為(88.20±9.41)、(79.00±11.39

14、)和(88.60±9.12)、(79.20±10.44)，高于C組(20.60±7.39)、(15.20±4.66)和D組(4.00±2.05)、(1.40±0.51)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有極顯著意義(P＜0.01)；其余各組的各種集落數(shù)兩兩比較，差異無(wú)顯著意義(P＞0.05)。A組與E組比較：兩組的各種集落數(shù)比較差異均無(wú)顯著性意義(P＞0.05)。 3.PRA對(duì)臍血造血干/祖細(xì)胞凋亡、壞死特征的影響流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果示：PRA

15、1000ul組的臍血造血干/祖細(xì)胞凋亡及壞死細(xì)胞百分率的值最高為(77.78±3.75)％，高于PRA500ul組(48.06±4.17)％、PRA0ul組(28.12±4.50)％和正常對(duì)照AB血清組(27.00±6.56)％，差異有極顯著意義(P＜0.01)；PRA500ul組的臍血造血干/祖細(xì)胞凋亡及壞死細(xì)胞百分率高于正常對(duì)照AB血清組，差異有極顯著意義(P＜0.01)，高于PRA0ul組，差異有顯著性意義(P＜0.05)；正常對(duì)

16、照AB血清組與PRA0ul組的臍血造血干/祖細(xì)胞凋亡及壞死細(xì)胞百分率比較，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異無(wú)顯著意義(P＞0.05)。 四、研究結(jié)論： 1.經(jīng)體外半固體集落培養(yǎng)結(jié)果證實(shí)：特異性PRA血清對(duì)臍血造血干/祖細(xì)胞具有損傷作用，對(duì)臍血造血干/祖細(xì)胞的增殖、分化能力具有顯著抑制作用。 2.經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果證明：在研究濃度范圍內(nèi)，特異性PRA血清對(duì)臍血造血干/祖細(xì)胞增殖、分化的抑制作用與PRA水平具有相關(guān)

17、性：特異性PRA水平越高，其抑制作用越強(qiáng)。 3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明：在體外，特異性PRA血清具有增加臍血造血干/祖細(xì)胞凋亡及壞死的作用。 4.經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果證明：在研究濃度范圍內(nèi)，特異性PRA血清水平與其增加臍血造血干/祖細(xì)胞凋亡及壞死的作用具有相關(guān)性，PRA水平越高，其增加細(xì)胞凋亡及壞死的作用越強(qiáng)，對(duì)細(xì)胞損傷越嚴(yán)重。 5.特異性PRA對(duì)臍血造血干/祖細(xì)胞的損傷，在體外可通過(guò)以下方面(包括