重型β-地中海貧血患兒異基因造血干細胞移植后的免疫恢復.pdf

1、研究背景：
　　 異基因造血干細胞移植(allogenic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)仍然是治愈遺傳性血紅蛋白病如重型β地中海貧血(Thalassemia Major，TM)患兒的唯一手段，但其臨床應用受到以下因素的限制，如預處理的相關毒性，供者細胞對受者細胞抗原的免疫反應引起的移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)

2、及延遲的免疫重建或免疫缺陷導致感染，復發(fā)及偶爾的排斥等等。造血干細胞移植后的免疫重建在成人已有較為深入的研究，但對于兒童研究很少。經過大劑量的化療后，受者免疫細胞的大量減少，但受者漿細胞往往可能持續(xù)存在至移植后數(shù)月到數(shù)年。移植前許多因素也可影響移植后的免疫狀態(tài)及其恢復，如年齡，干細胞來源，組織相容性抗原(histocompatibility antigen，HLA)相合的程度等等。移植后的急性GVHD，巨細胞病毒感染(cytomegal

3、ovirus，CMV)，免疫抑制劑應用、抗菌素，免疫球蛋白的應用及供者的淋巴細胞輸注(donor lymphocyte infusions，DLI)等均可影響移植后免疫的恢復。提高移植后的免疫重建是決定其臨床治療效果的重要因素。我們研究在TM的兒童在清髓性的allo-HSCT后2年內的T細胞亞群及體液免疫的恢復及其相關影響因素。
　　 研究目的：
　　 本課題旨在探討TM兒童在異基因外周血造血干細胞移植后2年內的免疫恢復

4、情況，評估CMV感染對T細胞亞群的影響，評估不同的供者年齡和受者年齡對體液免疫的恢復的影響，從而評估免疫細胞在造血干細胞移植中可能的作用，期望通過該研究為移植后免疫重建的快速恢復，減少移植后感染死亡提供指導意義。
　　 方法：
　　 我們回顧性的分析在南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院兒科層流病房進行外周血造血干細胞移植的地貧患兒免疫恢復情況。
　　 第一部分：移植后T細胞亞群的研究對象和方法
　　 第一節(jié):移植后半年

5、的T細胞亞群的研究對象和方法
　　 1.1)對于半年內的T細胞亞群的研究對象，入選研究范圍的標準是:2009年3月至2011年6月內所有在我中心的地中海貧血患兒行非親緣外周血造血干細胞移植的對象，在移植后半年的隨訪期間內未發(fā)生死亡或排斥，半年時完成T細胞亞群8項（包括CD3+、CD4+、CD8+、NK、CD4+CD45RA+、CD4+CD29+、CD8+CD28+、CD8+CD28-這八項）和血常規(guī)的評估，移植后截止于2012年

6、1月仍無病存活的病例。共有40例患兒，其中CMV感染有20例。評估其免疫恢復情況和CMV對其的影響。
　　 1.2)預處理方案
　　 患兒均給予清髓性的預處理方案，包括環(huán)磷酰胺（cyclosphosphamide，Cy）100-120mg/kg，d-10至d-9分兩天靜脈滴注，氟達拉濱(fludarabine，F(xiàn)lu)，200mg/m2，-6至-2天分5天靜脈滴注，塞替哌(thiotepa，TT)，10mg/kg，-5天

7、1天分兩次靜脈滴注，白消安(buslfan，BU)，9.6-17.6mg/kg，分3-4天靜脈注射(-8至-6天)。所有患兒給予環(huán)孢素A(cyclosporineA)，霉酚酸酯(mycophenolate mofetil，MMF)和ATG（-3--1天）預防GVHD。短療程的甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)在移植后第1，3，6天分別給予15，10and10mg/m2治療。肝素鈉預防肝靜脈阻塞綜合癥(hepatic veno-

8、occlusive disease，VOD)。
　　 1.3)移植前及移植后檢測及預防巨細胞病毒定量
　　 移植前常規(guī)進行更昔洛韋(10mg/kg)治療，療程8-10天。在allo-HSCT后中性粒細胞數(shù)＞0.5×109/L開始每周監(jiān)測CMV-DNA復制數(shù)，直到100天，移植后1月開始，常規(guī)進行每月7天的或每2月10天的預防性更昔洛韋治療。CMV感染定義為在外周血中可監(jiān)測到病毒的復制數(shù)，即＞500/ul。更昔洛韋的劑量或

9、改用磷甲酸鈉會依據(jù)患兒的腎功能和外周血中性粒細胞數(shù)進行調整，如外周血中性粒細胞數(shù)連續(xù)2天小于0.5×109/L停止更昔洛韋。
　　 1.4)植入的標準:移植后28天，第二個月，適當時甚至更長時間的檢測植入證據(jù)。
　　 間接指標:移植后臨床存活21天;各系統(tǒng)造血恢復正常，包括紅系，粒系，淋巴系，巨核系等，中性粒細胞數(shù)在0.5×109/L，血小板數(shù)維持在20×109/L;臨床上出現(xiàn)GVHD。腫大的肝脾回縮至正常大小;乳酸脫氫

10、酶降至正常水平。
　　 直接指標:供受者性別不同采用免疫熒光原位雜交法(fluorescence in situhybridization，F(xiàn)ISH)檢測性染色體的轉變，供受者性別相同采用短串聯(lián)重復序列(variable number of tandem repeat，VNTR)（HLA抗原轉變成供者型，或供者基因占受者的比例）。
　　 1.5)統(tǒng)計分析
　　 應用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，移植后巨細胞病

11、毒感染與否與半年內的T細胞亞群的恢復的影響。先采用單個樣本T檢驗對各個T細胞亞群數(shù)量與設定的參考值進行比較，然后將患兒按有無CMV感染分組，采用獨立two-samplestTest檢驗方法比較。組間的基礎指標的分類變量采用卡方比較，等級資料可采用獨立樣本的非參數(shù)檢驗（Mann-Whitney），定量變量采用2個樣本的t檢驗比較。采用線性相關分析分析T細胞亞群CD8+細胞之間的相關性。P值小于0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　 第二節(jié)

12、：移植后1年的T細胞亞群的研究對象和方法
　　 對于1年內的T細胞亞群的研究對象，入選研究范圍的標準是:2009年3月至2011年1月內在我中心的地中海貧血患兒行非親緣外周血造血干細胞移植的對象，在移植后1年以上的隨訪期間內未發(fā)生死亡或排斥，移植后截止于2012年1月仍無病存活的病例，移植后1年完成T細胞亞群4項（至少包括CD3+、CD4+、CD8+、NK這四項）及血常規(guī)的評估。病人共有38例。對其病毒的檢測與植入檢測同上。應用

13、SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用單個樣本t檢驗對各個T細胞亞群數(shù)量與設定的參考值進行比較。P值小于0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　 第二部分：移植后體液免疫的研究對象和方法
　　 第一節(jié)：移植后半年的體液免疫的研究對象和方法
　　 對于半年內的體液免疫的研究對象，入選研究范圍的標準是:2010年3月至2011年6月內所有在我中心的地中海貧血患兒行外周血造血干細胞移植的對象，在移植后半年的隨訪期間內未發(fā)生死亡或

14、排斥，半年時完成體液免疫的免疫評估，移植后截止于2012年1月仍無病存活的病例，病人共有35例。對其病毒的檢測與植入證據(jù)檢測同上。應用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，先采用單個樣本t檢驗對各個年齡段的體液免疫與設定的參考值進行比較，患兒年齡，供者年齡與移植后半年內體液免疫的恢復的影響，采用雙變量的Pearson相關分別分析。P值小于0.05為有統(tǒng)計學意義
　　 第二節(jié)：移植后1年的體液免疫的研究對象和方法
　　 對于1

15、年內的體液免疫的研究對象，入選研究范圍的標準是:2009年3月至2011年1月內所有在我中心的地中海貧血患兒行外周血造血干細胞移植的對象，在移植后1年的隨訪期間內未發(fā)生死亡或排斥，移植后1年完成體液免疫評估，移植后截止于2012年1月仍無病存活的病例。病人共有35例。對其病毒的檢測與植入證據(jù)檢測同上。應用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用單個樣本t檢驗對各個年齡段的體液免疫與設定的參考值進行比較。P值小于0.05為有統(tǒng)計學意義。

16、r>　　 結果：
　　 第一部分：T細胞亞群的情況
　　 第一節(jié)：移植后半年的T細胞亞群的恢復
　　 (1)半年的T細胞亞群內CD3+細胞的均值1.46×109/L,NK細胞均值0.33×109/L，CD4+細胞均值0.25×109/L，CD8+細胞均值1.14×109/L，其中CD4+細胞低于設定參考值0.5×109/L水平(t=-6.874，P＜0.001)。
　　 (2)CMV感染組的半年CD3+

17、、CD8+、CDS+CD28-的細胞數(shù)分別為1.87±1.47×109/L、1.51±1.27×109/L、1.20±1.13×109/L，明顯高于巨細胞病毒未感染組，其細胞數(shù)分別是1.05±0.60×109/L、0.78±0.50×109/L、0.51±0.41×109/L（分別為t=-2.315，P=0.029;t=-2.414，P=0.024;t=-2.540，P=0.018;），其兩組的CD8+CD28-比率分別是46.17％±

18、19.68％，33.32％±12.50％(t=-2.465，P=0.018)。
　　 (3)在CMV感染組內，CD8+細胞與CD8+CD28-細胞呈線性正相關(r=0.980，P＜0.001)，而與CD8+CD28+T細胞數(shù)負相關，但無直線線性相關(r=0.585，P=0.007)。
　　 第二節(jié)：移植后1年以上的T細胞亞群的恢復
　　 地中海貧血患兒在造血干細胞移植后1年以上T細胞亞群內CD3+細胞的均值2.2

19、2×109/L，NK細胞均值0.27×109/L，CD4+細胞均值0.63×109/L。
　　 第二部分：體液免疫的情況
　　 第一節(jié)：移植后半年的體液免疫恢復
　　 (1)地中海貧血患兒移植后半年的免疫球蛋白水平，3-6歲的IgA、IgM，IgG的平均值和標準差分別是0.40±0.22g/L、0.71±0.35g/L、7.17±2.30g/L，其中IgA、IgM恢復低于正常同齡兒童水平(分別t=-8.467，P

20、＜0.001;t=-2.305，P=0.042)，＞7歲的IgA、IgM，IgG的平均值和標準差分別是0.81±0.71g/L、1.02±0.40g/L、8.13±3.28g/L，均低于正常同齡兒童水平(分別t=-2.305，P=0.042;t=-6.161,P＜0.001;t=-2.733,P=0.019)。
　　 (2)移植后的抗體水平和供者年齡無關，但患兒年齡分別與IgA，C3，C4的水平成正相關關系，相關系數(shù)分別是0.6

21、67、0.511、0.341，P值分別＜0.001、0.002、0.045。
　　 (3)2例脾切除后的患兒在造血干細胞移植后半年內的IgA、IgM，IgG的平均值分別1.58g/L，0.76g/L，14.25g/L。
　　 第二節(jié)：移植后1年以上的體液免疫恢復
　　 1年后地貧患兒的3-6歲的IgA，IgG，IgM的均值和標準差分別是0.83±0.40g/L、9.81±2.92g/L、0.86±0.27g/L，

22、＞7歲的IgA，IgG，IgM的均值和標準差分別是1.35±0.74g/L、11.45±4.85g/L、1.05±0.53g/L。兩年齡段IgM低于正常同齡兒童(t分別為-8.982，-5.380，P均為＜0.001)。
　　 結論：
　　 (1)TM兒童allo-HSCT后半年時NK細胞數(shù)比率及CD4+細胞數(shù)和比率不受CMV感染與否的影響，除了CD4+細胞數(shù)低于0.5×109/L外，其余均恢復正常。但一年后的患兒的T細

23、胞各亞群處于正常參考值水平。
　　 (2)TM兒童allo-HSCT后的巨細胞病毒感染會導致高的CD8+細胞中的CD8+CD28-細胞的單克隆擴增，從而改變T細胞亞群的之間的轉化率，且CD8+細胞升高比率與CD8+CD28-比率呈直線線性相關。
　　 (3)對于TM兒童allo-HSCT后半年時免疫球蛋白水平均低于正常同齡兒童，除了3-6歲的IgG水平外;同時患兒年齡與IgA，C3，C4的恢復成正相關。
　　 (