人類巨細胞病毒感染對臍血粒單系祖細胞增殖過程中HOXA5，HOXB6基因表達的影響.pdf

1、目的：本課題主要探討人類造血干祖細胞(HematopoieticStem-ProgenitorCell，HSPC)向粒單系(ColonyFormingUnit-Granulocyte-macrophage，CFU-GM)增殖過程中HOXB6，HOXA5基因表達的情況，并且用人類巨細胞病毒(HumanCytomegalovirus，HCMV)和/或全反式維甲酸(all-trans-retinoticacid，ATRA)進行干擾，以探討HC

2、MV、ATRA在此過程中對HOXB6、HOXA5基因的影響，以進一步明確HCMV抑制臍血粒單系祖細胞增殖的機制，以及ATRA能有效治療粒系白血病，尤其是急性早幼粒細胞白血病的可能機制。 方法：1.臍血標本由本院產(chǎn)房提供，取自正常足月順產(chǎn)新生兒斷臍后的胎盤段臍血。 2.實驗分組。實驗分4組：(1)空白對照組：不加病毒液，代之等量IMDM加入基本培養(yǎng)體系。(2)HCMV組：HCMV-AD169滴度為組織培養(yǎng)半數(shù)感染量(tis

3、suecultureinfectious，TCID50)10-4.5/0.1ml，按100TCID500.1ml感染培養(yǎng)體系。(3)ATRA組：加入ATRA稀釋液0.1ml，終濃度60nmol/()l。(4)HCMV+ATRA組：同時加入HCMV-AD169病毒稀釋液0.1ml及ATRA0.1ml，終濃度同上。 3.采用造血祖細胞體外培養(yǎng)技術(shù)，以HCMV-AD169和/或ATRA持續(xù)干擾人類造血干祖細胞，觀察正常組、HCMV-A

4、D169組、ATRA組、以及ATRA+HCMV組的人類造血干祖細胞經(jīng)人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophagecolony-stimulating，GM-CSF)誘導后，在培養(yǎng)過程第3天，7天和12天的粒單系祖細胞集落(ColonyFormingUnit-Granulocyte-macrophage,CFU-GM)生成情況。 4.采用瑞-姬染色法鑒定粒單系祖細胞。 5.分別抽提各時間點，各

5、不同分組細胞總RNA。 6.將抽提到的各時間點，不同分組細胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為CDNA，通過實時定量PCR技術(shù)(Real-timeQuantitativePolymerasechainReaction，RQ-PCR)檢測各組細胞增殖分化過程中HOXB6、HOXA5基因的表達情況。 7.隨機抽取6例逆轉(zhuǎn)錄的HOXB6、HOXA5基因進行電泳，獲得HOXB6、HOXA5電泳圖。 8.統(tǒng)計方法：結(jié)果用DNA相對拷貝數(shù)和R

6、NA表達相對量(2-△△Ct)表示HOXB6、HOXA5基因相對表達量，采用均數(shù)加減標準差((-X)±S)表示HOXB6、HOXA5基因的變化情況。進行方差齊性檢驗，ONE-WAY方差分析，組間均數(shù)兩兩比較用LSD法。由統(tǒng)計學軟件SPSS13.0完成。 結(jié)果：(1)人類造血干祖細胞向粒單系祖細胞增殖分化過程中，正常對照組、HCMV組、ATRA組、及HCMV+ATRA組的HOXA5基因均不規(guī)律表達，且表達多為陰性。(2)HOXB6

7、基因在各組均表達，且表達強烈。(3)隨時間推移，正常對照組、HCMV組、ATRA組、及HCMV+ATRA組，HOXB6基因均在增殖分化的第7天表達最強烈，第12天表達明顯減弱。(4)與正常對照組比較，HOXB6基因受ATRA(60nmol/()l)的上調(diào)。(5)與正常對照組比較，HOXB6基因受HCMV下調(diào)。(6)與HCMV組比較，ATRA能抑制HCMV所致的HOXB6基因下調(diào)。(7)提取的總RNA經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖，可見28

8、S、18S、5S三條帶，無DNA污染條帶，無明顯降解條帶，表明提取的總RNA純度較高。(8)1.5％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見HOXB6、HOXA5基因DNA擴增條帶清晰，沒有雜帶，說明引物設(shè)計合成無誤。(9)RQ-PCR方法定量目的基因具有特異性好，靈敏度高等優(yōu)點。 結(jié)論：1.HOXA5基因可能不是人類造血干祖細胞向粒單系祖細胞增殖分化過程的主控基因。 2.HOXB6基因是人類造血干祖細胞向粒單系祖細胞增殖分化過程的主控基因

9、之一。 3.HOXB6基因在人類造血干祖細胞向粒單系細胞的正常增殖分化過程中呈現(xiàn)時間上的規(guī)律性。 4.HCMV能下調(diào)HOXB6基因的表達，同時經(jīng)HCMV干擾的細胞在倒置顯微鏡下觀察，集落生成較正常組差。HCMV可能通過調(diào)控HOXB6基因表達異常引起造血干祖細胞增殖分化異常。 5.低濃度(60nmol/()l)ATRA能顯著上調(diào)HOXB6基因的表達，提示ATRA治療白血病的機制可能與其調(diào)控同源盒基因有關(guān)。