人類巨細(xì)胞病毒感染對(duì)淋巴系祖細(xì)胞增殖過程中HOXC4，HOXC6基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的：本課題主要探討人類臍血造血干細(xì)胞(Hematopoiefic Stem Cell，HSC)向淋巴系祖細(xì)胞(Colony Forming Unit-T Lymphocyte，CFU-TL)增殖過程中HOXC4、HOXC6基因表達(dá)的情況，并且用人類巨細(xì)胞病毒(Human Cytomegalovirus，HCMV)和/或全反式維甲酸(all-aans-retinoicacid，ATRA)進(jìn)行干擾，采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(fl

2、uorogenicquantitive reverse transcription polymerize cham reaction，F(xiàn)Q-RT-PCR)方法，以探討HCMV、ATRA在此過程中對(duì)HOXC4、HOXC6基因的影響，在基因水平探討HCMV感染導(dǎo)致臍血淋巴系祖細(xì)胞損傷的機(jī)制。 方法： 1．12例臍血標(biāo)本由本院產(chǎn)房提供，取自正常足月順產(chǎn)新生兒斷臍后的胎盤段臍血。 2．實(shí)驗(yàn)分組。實(shí)驗(yàn)分4組： (1

3、)空白對(duì)照組：不加病毒液，代之等量1640培養(yǎng)基加入基本培養(yǎng)體系。 (2)HCMV組：HCMV-AD169滴度為組織培養(yǎng)半數(shù)感染量(tissue culture infectious，TCID50)10-4.5/0.1ml，按100TCID500.1ml感染培養(yǎng)體系。 (3)HCMV+ATRA組：同時(shí)加入HCMV-AD169病毒稀釋液0.1ml及ATRA 0.1ml，終濃度同上。(4)ATRA組：加入ATRA稀釋液0.1

4、ml，終濃度6×10-8mol/l。 3.采用造血祖細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)，以HCMV-AD169和(或)ATRA持續(xù)干擾人類造血干細(xì)胞，觀察正常組、HCMV-AD169組、ATRA+HCMV組、ATRA組的人類造血干祖細(xì)胞經(jīng)植物血凝素(Phytohemagglutinin，PHA-M)誘導(dǎo)后，在培養(yǎng)過程第3天，7天和12天的淋巴系祖細(xì)胞集落生成情況。 4．采用瑞-姬染色法鑒定CFU-TL集落細(xì)胞成分。 5．不同時(shí)間點(diǎn)

5、即第3天、第7天、第12天分別提取各組細(xì)胞RNA，用1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA分子的完整性。 6．將抽提到的各時(shí)間點(diǎn)，不同分組細(xì)胞通過隨機(jī)引物將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)臍血淋巴系祖細(xì)胞增殖分化過程中各組HOXC4、HOXC6基因的表達(dá)。 7．通過電泳實(shí)驗(yàn)分別獲得HOXC4、HOXC6在3天、7天、12天電泳圖。 8．統(tǒng)計(jì)方法：結(jié)果用RNA表達(dá)相對(duì)量(2-△△Ct)表示HOX4

6、、HOXC6基因相對(duì)表達(dá)量，采用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(-X±S)表示HOX4、HOXC6基因的變化情況。進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，ONE-WAY方差分析，組間均數(shù)兩兩比較用LSD法。由統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS14.0完成。 結(jié)果： 1．集落細(xì)胞的形態(tài)學(xué)鑒定，瑞-姬染色法證明所培養(yǎng)的是淋巴系祖細(xì)胞。 2．1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳顯示RNA電泳圖的5s,18s,28s三條帶型整齊，無明顯拖尾及彌散，說明RNA結(jié)構(gòu)完整，無明顯降解。

7、 3．逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增三組均有目的基因HOXC4、HOXC6和內(nèi)參照GAPDH基因的cDNA的產(chǎn)物，與DNA分子Marker相比示擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為：HOXC4為254個(gè)堿基(bp)，HOXC6為212 bp，GAPDH基因?yàn)?41 bp，與預(yù)定理論值大小符合。 4．隨時(shí)間推移，正常對(duì)照組、HCMV組、 ATRA組、及HCMV+ATRA組，HOXC4、HOXC6基因均在增殖分化的第7天表達(dá)最強(qiáng)烈，第12天表達(dá)明顯減弱。

8、 5．各組中HOXC4基因表達(dá)量高于HOXC6組。 6．與正常對(duì)照組比較，HOXC4、HOXC6基因受ATRA(6×10-8mol/L)的上調(diào)，而HOXC4、HOXC6基因受HCMV下調(diào)。 7．與HCMV組比較，ATRA有抑制HCMV所致的HOXC4、HOXC6基因的下調(diào)作用。 結(jié)論： 1．HOXC4、HOXC6基因在臍血淋巴系祖細(xì)胞中呈現(xiàn)規(guī)律的表達(dá)，提示HOXC4、HOXC6均與淋巴系造血有密切的相關(guān)

9、性。 2．人類造血干細(xì)胞向淋巴系祖細(xì)胞增殖分化過程中，正常對(duì)照組、HCMV組、 ATRA組、及HCMV+ATRA組的HOXC4、HOXC6呈規(guī)律表達(dá)，第3天少量表達(dá)，第7天表達(dá)最強(qiáng)烈，第12天表達(dá)明顯下降。 3．HOXC4基因在人類造血干細(xì)胞向淋巴系祖細(xì)胞的正常增殖分化過程中表達(dá)均較HOXC6強(qiáng)烈，說明HOXC4是淋巴系祖細(xì)胞中的主要基因之一。 4．HCMV能使HOXC4、HOXC6基因表達(dá)下調(diào)，提示HCMV可能