經(jīng)HCMV感染的人臍血造血干細胞向淋巴系祖細胞增殖過程中Hoxb4、Hoxb6基因的表達.pdf

1、目的：探討經(jīng)人類巨細胞病毒(Human Cytomegalovirus，HCMV)感染的人臍血造血干細胞(Hematopoietic Stem Cell，HSC)向淋巴系造血祖細胞(或稱淋巴細胞集落生成單位，Colony Forming Unit-T Lymphocyte，CFU-TL)增殖分化過程中同源盒(homeobox，hox)b4基因(hoxb4 gene)、hoxb6基因(hoxb6 gene)表達的情況，以及用HCMV和/或

2、全反式維甲酸(all-trans-retinoic acid，ATRA)對其進行干擾后，采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(fluorogenic quantitive reverse transcription polymerize chain reaction，F(xiàn)Q-RT-PCR)技術檢測其hoxb4、hoxb6基因信使核糖核酸(messenger-ribonucleic acid，mRNA)的表達情況，從而探討HCMV、ATRA在

3、此過程中對hoxb4、hoxb6基因表達的影響，在基因水平探討HCMV感染導致臍血淋巴系祖細胞損傷的機制。 方法：1．取正常健康母親正常足月順產(chǎn)兒斷臍后的胎盤段臍血。2．實驗分組：實驗分4組：(1)空白對照組(BLANK組)：正常培養(yǎng)體系，不加予任何處理因素。(2)HCMV組：僅以人巨細胞病毒-AD169(Human cytomegalovirus—AD169，HCMV-AD169)病毒液按105蝕斑形成單位(plaque fo

4、rmation unit，pFU)/ml 0.1ml感染正常培養(yǎng)體系。(3)HCMV+ATRA組：同時加入HCMV-AD169病毒液0.1ml及ATRA 0.1ml，終濃度為6×10-8mol/l。(4)ATRA組：僅在正常培養(yǎng)體系中加入ATRA 0.1ml，終濃度同上。3．采用造血祖細胞體外培養(yǎng)技術，以HCMV-AD169和(或)ATRA持續(xù)干擾人類造血干細胞，觀察不同時間點各組的人類造血干祖細胞經(jīng)植物血凝素(Phytohemaggl

5、utinin M，PHA-M)誘導后的淋巴系祖細胞集落生成情況。4．采用瑞-姬染色法鑒定CFU-TL集落細胞成分。5．在不同時間點即第3天、第7天、第12天分別提取各組細胞核糖核酸(ribonucleicacid，RNA)，用1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA分子的完整性。6．將抽提到的各時間點，不同分組細胞通過隨機引物將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補脫氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid，cDNA

6、)，采用FQ-RT-PCR技術檢測臍血淋巴系祖細胞增殖分化過程中各組hoxb4、hoxb6基因的表達。7．通過RNA電泳分別獲得各組hoxb4、hoxb6在3天、7天、12天RNA電泳圖并進行數(shù)據(jù)處理和分析。8．數(shù)據(jù)處理：以均數(shù)加減標準差(-x±S)表示hoxb4、hoxb6基因的變化情況進行方差齊性檢驗，TWO-WAY方差分析，有統(tǒng)計學意義后組間均數(shù)兩兩比較(LSD法)進行統(tǒng)計分析。所有統(tǒng)計工作均由統(tǒng)計學軟件SPSS 15.0 for

7、 Windows完成。 結果：1．集落細胞的形態(tài)學鑒定，瑞-姬染色法證明所培養(yǎng)的是淋巴系祖細胞。 2．1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳顯示RNA電泳圖的5s,18s,28s三條帶型整齊，無明顯拖尾及彌散，說明RNA結構基本完整，無明顯降解。3．逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增各組均有目的基因hoxb4、hoxb6和內(nèi)參照人磷酸甘油醛脫氫酶(gluceraldehyde phospha

8、tedehydrogenase，gapdh)基因的cDNA的產(chǎn)物，與DNA分子Marker相比示擴增產(chǎn)物大小分別為：hoxb4為138個堿基對(base pair，bp)，hoxb6為119 bp，gapdh基因為141 bp，與預定理論值大小符合。4．人臍血造血干細胞向淋巴系造血祖細胞增殖分化過程中(體外)，各組的hoxb4、hoxb6基因均有表達，且隨時間推移，hoxb4基因的相對表達量逐漸降低；而hoxb6基因的相對表達量在增殖分

9、化的第7天最高，第12天降低。5．與BLANK組比較，ATRA組的hoxb4、hoxb6基因相對表達量較BLANK組顯著為高，而HCMV組的hoxb4、hoxb6基因相對表達量較BLANK組為低。6．與HCMV組比較，HCMV+ATRA組的hoxb4、hoxb6基因的相對表達量較HCMV組為高。 結論：1．Hoxb4、hoxb6基因在臍血淋巴系祖細胞中(體外)均有表達，與淋巴系造血呈現(xiàn)一定的相關性。2．人臍血造血干細胞向淋巴系造

10、血祖細胞增殖分化過程中(體外)，隨時間推移，hoxb4基因表達逐漸減弱。3．在人臍血造血干細胞向淋巴系造血祖細胞增殖分化過程中(體外)，隨時間推移，hoxb6基因表達在增殖分化的第7天表達較強烈，第12天表達減弱。4．HCMV能下調(diào)淋巴系祖細胞hoxb4、hoxb6基因的表達(體外)，提示HCMV可能通過調(diào)控hoxb4、hoxb6基因表達異常引起造血功能異常。5．ATRA不僅能顯著上調(diào)正常淋巴系祖細胞hoxb4、hoxb6基因的表達，而