環(huán)酰亞胺類肽化合物對明膠酶活性作用及4i抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用研究.pdf

1、研究背景：腫瘤浸潤與轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞與機(jī)體相互作用的極其復(fù)雜的多環(huán)節(jié)過程，其中腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生和釋放多種水解酶降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)或基底膜(BM)可能是浸潤與轉(zhuǎn)移的主要內(nèi)容。BM的主要成分之一Ⅳ型膠原分子由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，大部分蛋白酶對其無降解作用，而Ⅳ型膠原酶可特異性降解Ⅳ型膠原而破壞基底膜的完整性。Ⅳ型膠原酶即基質(zhì)金屬蛋白酶-2，基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-2，MMP-9)又稱明膠酶，屬基質(zhì)金屬蛋白酶家族，它參與調(diào)控ECM的更新，維持

2、細(xì)胞的穩(wěn)定性，已被證明參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多個環(huán)節(jié)，抑制該酶活性就能有效地控制腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。因此，針對這一靶點(diǎn)設(shè)計(jì)、合成明膠酶抑制劑是當(dāng)前抗腫瘤藥物研究發(fā)展最快的領(lǐng)域。 基于MMP-2-9結(jié)構(gòu)并分析參比化合物抗瘤酮A10和沙利度胺化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)后，設(shè)計(jì)合成了以結(jié)構(gòu)狹長空間取向穩(wěn)定，易進(jìn)入明膠酶活性中心位點(diǎn)Sl’結(jié)合腔為特點(diǎn)的一系列環(huán)酰亞胺小分子類肽化合物，用于對Ⅳ型膠原酶抑制活性的篩選和抗腫瘤轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。以Iv型膠原酶為靶點(diǎn)

3、，在對化合物活性篩選的基礎(chǔ)上，我們對化合物4i進(jìn)行了重點(diǎn)研究。 實(shí)驗(yàn)方法：化合物活性篩選實(shí)驗(yàn)，以琥珀酰明膠降解法檢測化合物對人Ⅳ型膠原酶活性抑制作用：以MTT法檢測化合物對人卵巢上皮癌細(xì)胞SKOV3生長的影響，評價其對細(xì)胞的作用性質(zhì)；以SDS-PAGE明膠酶譜分析SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)上清液MMP-2，-9水平，評價化合物對酶活性的影響。 研究化合物4i抗腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移作用，分別以MTT和細(xì)胞克隆生長實(shí)驗(yàn)法觀察其對SKO

4、V3生長抑制作用；以臺盼藍(lán)染色法，檢查化合物處理細(xì)胞藍(lán)染細(xì)胞比例，評價化合物對腫瘤細(xì)胞抑制作用性質(zhì)。以MTIT法評價腫瘤細(xì)胞與基底膜蛋白的黏附能力。在觀察4i對MMP-2和MMP-9活性實(shí)驗(yàn)方面，我們分別以明膠酶化學(xué)法分析4i對人Ⅳ型膠原酶的抑制作用；以明膠酶譜法分析培養(yǎng)細(xì)胞上清液MMP-2,-9活性：以Western blot法檢測腫瘤細(xì)胞-pro-MMP-2和MMP-2，-9表達(dá)水平；以免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測腫瘤細(xì)胞表達(dá)MMP-2，-9

5、水平。我們還分別以RT-PCR法觀察了4i對SKOV3細(xì)胞表達(dá)MMP-2和MMP-9 mRNA的影響。在活性評價方面，以transwell chamber法觀察了4i對SKOV3細(xì)胞穿過人工基底膜的抑制作用；分別以尾靜脈注射腫瘤細(xì)胞H22和SKOV3致小鼠肺轉(zhuǎn)移模型，評價4i對體內(nèi)生長腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制作用。另外，實(shí)驗(yàn)還以Western blotting法測定了化合物對腫瘤細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮因子VEGF的影響，并將4i與雞胚尿囊膜(CAM

6、)直接接觸，觀察其對微血管生成的抑制作用。 結(jié)果：環(huán)酰亞胺小分子類肽化合物對SKOV3細(xì)胞具有較弱的生長抑制作用，與細(xì)胞接觸72 h，劑量l00 κB以下時，大多數(shù)化合物對腫瘤細(xì)胞生長抑制率低于30％；劑量達(dá)200 μg/ml并持續(xù)接觸72 h時，最高抑制率為48.54％。琥珀酰明膠法檢測化合物對Ⅳ型膠原酶活性的影響，多數(shù)化合物具有對Ⅳ型膠原酶活性的抑制作用。以SDS-PAGE酶譜分析法，檢測化合物對SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)液MMP-

7、2和MMP-9活性影響，篩選出了編號分別為4i,4r,pro-13，9+HNEt6，4a，4q的化合物對MMP-2和MMP-9活性抑制作用較強(qiáng)，具有進(jìn)一步研究的價值，本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究了化合物4i的藥理學(xué)活性。 與明膠酶直接孵育30 min，化合物4i抑制明膠酶活性的IC50為394.7l±1.58ng/ml；與SKOV3細(xì)胞接觸24 h，4i(5-150μg/ml )對培養(yǎng)上清中MMP-9抑制率分別為12.7，16.9，34.8，

8、63.9和82.53％;對MMP-2抑制率分別為8.3，14.8，25.8，26.9和35.8％。免疫細(xì)胞化學(xué)法可見4i明顯減少腫瘤細(xì)胞MMP-2，MMP-9表達(dá)率，抑制率分別達(dá)到78.77％和75.21％。以Western blotting分析發(fā)現(xiàn)該化合物對pro-MMP-2，MMP-2，MMP-9表達(dá)抑制作用較明顯(P<0.05)，并呈現(xiàn)量效依賴關(guān)系。觀察化合物是否干擾腫瘤細(xì)胞MMP-2,-9 mRNA表達(dá)功能，以RT-PCR法發(fā)現(xiàn)

9、，較高劑量(150 μg/ml)對MMP-2,-9的mRNA表達(dá)水平抑制作用強(qiáng)，低劑量(50μg/ml)對MMP-9抑制作用弱。與4i接觸24 h，SKOV3細(xì)胞穿過人工基底膜數(shù)量下降，顯示具有抑制腫瘤細(xì)胞侵襲與游走的能力。以25和100 mg/kg口服給藥28 d，4i能夠降低腫瘤細(xì)胞在小鼠肺形成轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量。對H22肝癌肺結(jié)節(jié)形成的抑制率為21.1％和35.3％；對裸鼠微靜脈注射人SKOV3細(xì)胞肺結(jié)節(jié)抑制率為46.5％。另外，4i阻