靶向微管新結構雙吲哚馬來酰亞胺化合物HD-ZWM-288抗腫瘤作用的研究.pdf

1、惡性腫瘤是當今危害人類健康甚至危及生命的主要疾病之一，其發(fā)病率逐年上升。乳腺癌和肝癌都是十分常見的惡性腫瘤，因其具有易轉移并且易產(chǎn)生耐藥性等特點，使得尋找毒性低同時療效好的新型化療藥物也成為目前腫瘤治療方面的一個重要的研究方向。中國海洋大學朱偉明課題組在從海洋微生物中發(fā)現(xiàn)抗腫瘤活性的新吲哚咔巴唑生物堿的基礎上，開展了對雙吲哚馬來酰亞胺類生物堿結構修飾和構效關系的研究工作，設計并合成了一系列雙吲哚馬來酰亞胺類化合物，它們是一類具有烷基和腈

2、基鏈的取代的結構。我們的前期研究已表明這些化合物能夠抑制多株腫瘤細胞的生長。本文在發(fā)現(xiàn)HD-ZWM-288靶向微管的基礎上，深入研究了其微管介導的抗腫瘤作用機制。
　　在對化合物篩選中，我們發(fā)現(xiàn)HD-ZWM-288有抑制微管的作用。以MCF-7細胞株和MDA-MB-231細胞株為研究對象，MTT法檢測了HD-ZWM-288對它們的生長抑制作用，并呈現(xiàn)出時間和劑量的依賴性。我們建立了裸鼠皮下移植瘤模型，連續(xù)給藥兩周，結果表明HD-Z

3、WM-288體內也能夠抑制腫瘤生長。免疫熒光染色、Western Blot和免疫組化染色實驗的結果均表明，HD-ZWM-288在體內和體外都具有抑制微管蛋白的作用。用流式檢測發(fā)現(xiàn)化合物處理后的細胞被阻滯在G2/M周期。延長給藥時間，通過DAPI染色和AnnexinⅤ和PI雙染這些手段發(fā)現(xiàn)與對照組相比加入了HD-ZWM-288后的細胞皺縮、染色質聚集和凋亡率增加，這些結果提示該化合物最終可能通過細胞凋亡的方式誘導細胞死亡。綜上所述，HD-

4、ZWM-288抑制乳腺癌細胞增殖，首先它抑制微管蛋白聚合，導致cdc2、p-cdc2蛋白表達下降，使細胞停滯于G2/M期，進一步抑制增殖，最終導致細胞凋亡。
　　肝癌的發(fā)生與惡化與細胞本身的增殖、凋亡和分化三者之間達成的平衡失穩(wěn)息息相關。通過MTT法檢測的結果顯示HD-ZWM-288能夠抑制HepG-2細胞株的增殖。同樣建立裸鼠單側腋下皮下HepG-2移植瘤模型，結果證明在體內它也能抑制HepG-2移植瘤生長。通過流式細胞術檢測，

5、發(fā)現(xiàn)HD-ZWM-288可以誘導HepG-2凋亡并且使細胞停滯在G2/M期。采用DAPI染色同樣發(fā)現(xiàn)化合物處理細胞后出現(xiàn)典型的凋亡特點。Western Blot檢測結果表明cyclinB1的蛋白表達水平增加，cdc2和p-cdc2的蛋白表達水平下降，進一步證明G2/M期阻滯是由于HD-ZWM-288影響細胞的周期相關蛋白導致的。選用Western Blot檢測加藥后磷酸化H2AX的表達變化，表明化合物作用后出現(xiàn)了DNA雙鏈斷裂。在HD-

6、ZWM-288誘導HepG-2細胞凋亡的信號轉導途徑中，我們還發(fā)現(xiàn)化合物作用于細胞后ROS的顯著增加，Bcl-2/Bax這兩者的蛋白表達率顯著降低，線粒體膜電勢崩潰和細胞色素C釋放，進而激活了caspase-9，caspase-3和PARP這一級聯(lián)反應，最終導致細胞凋亡。綜上所述，HD-ZWM-288首先造成HepG-2細胞DNA損傷，進一步導致細胞周期阻滯，無法修復損傷的細胞則啟動了線粒體途徑的凋亡。
　　血管生成是腫瘤的發(fā)生、

7、生長以及轉移過程當中必不可少的關鍵所在。MTT結果說明HD-ZWM-288能抑制血管內皮細胞HUVEC的生長。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在較低劑量下，化合物對遷移和管形成有明顯的抑制作用。此外，還采用雞胚尿囊膜實驗和建立的裸鼠皮下移植瘤模型對化合物的抗新生血管作用進行評價。CAM和免疫組織化學實驗結果均表明HD-ZWM-288在體內也可以有效地發(fā)揮抑制血管生成的作用。在轉錄和翻譯水平上檢測了在血管形成中起到重要作用的分子和相關通路，結果表明HD-