靶向微管雙吲哚類化合物的篩選及HD-ZWM-288抗腫瘤多藥耐藥的研究.pdf

1、近年來，全球新發(fā)癌癥病例及死亡人數(shù)逐年上升。由于微管在有絲分裂事件中的作用，其已經(jīng)是醫(yī)學上經(jīng)過驗證的化療藥物的靶點。我們首先對基于微管靶點的化合物進行篩選，所采用的雙吲哚類化合物是在從海洋微生物中發(fā)現(xiàn)的具有良好抗癌生物活性的新吲哚咔巴唑生物堿的基礎上，對已有的雙吲哚類化合物進行修飾和改造得到的。
　　在前期工作的基礎上，我們最終選用這十五個化合物進行微管作用的篩選。我們對首先分析實驗中的十五個化合物對細胞周期的作用。結果顯示，大部

2、分所選用的雙吲哚類化合物都有不同程度的周期阻滯作用。其中，在具有G2/M期阻滯作用的化合物中，HD-ZWM-288,HD-ZWM-597的作用最強。因此，我們推測HD-ZWM-288,HD-ZWM-597可能具有靶向微管的抗腫瘤活性。但由于HD-ZWM-597在體外實驗中毒性較大，HD-ZWM-288作為候選先導物進行深入的體內外靶向微管的抗腫瘤作用及其機制的研究。對HD-ZWM-288進行計算機擬合分析，結果顯示HD-ZWM-288與

3、靶點有非常好的對接。鑒于以上的實驗結果，我們推測HD-ZWM-288具有較好的靶向微管藥物的潛力，后續(xù)的試驗及機制的研究由李琳師姐完成，并且后續(xù)的研究表明，HD-ZWM-288確實具有良好的靶向微管的抗腫瘤的作用。
　　但是，大多數(shù)微管抑制劑的副作用較大，并且使用過程中較易出現(xiàn)耐藥性。因此，急需開發(fā)活性更強、副作用較小，并且對多藥耐藥細胞也有效的新型微管抑制劑。在對化合物HD-ZWM-288的抗腫瘤的機制研究過程中，我們發(fā)現(xiàn)其具有

4、較好的抗多藥耐藥的作用。
　　MTT實驗結果表明，相對于阿霉素和長春新堿，HD-ZWM-288對MDR細胞表現(xiàn)出有效的細胞毒性，尤其對K562/A02及K562這一組細胞作用最明顯。而對正常細胞具有較小的細胞毒性。不同濃度HD-ZWM-288作用的K562/A02及K562細胞12h，在顯微鏡下可以觀察到細胞膜皺縮，細胞裂解成碎片等形態(tài)變化。AnnexinⅤ/PI雙染法以及Western blot結果表明，HD-ZWM-288可以

5、誘導K562/A02及K562細胞產生凋亡。
　　MDR的產生機制中最常見的是ATP結合膜轉運蛋白家族過量表達誘發(fā)細胞外排作用增強。流式細胞儀分析結果說明，在HD-ZWM-288可以誘導K562/A02及K562細胞內的羅丹明的積累量呈濃度依賴性增加。Western Blot及實時定量PCR實驗說明HD-ZWM-288可以抑制P-gp的表達及轉錄水平?；谶@些實驗結果，HD-ZWM-288是通過有效地抑制P-gp的作用，促進細胞內

6、藥物的積累量，誘導耐藥腫瘤細胞細胞凋亡。
　　影響P-gp表達的信號通路主要有ROS、MAPK、PI3K/AKT、及NF-κB信號通路。在本研究中，HD-ZWM-288可以誘導細胞內ROS的水平升高，線粒體膜電位下降，以及細胞色素C的釋放。這些試驗結果說明，HD-ZWM-288可能是通過ROS的產生來影響B(tài)cl-2和Bax的表達，從而引起細胞凋亡。作為ROS的下游信號，MAPK與腫瘤的耐藥性息息相關。在本研究中，HD-ZWM-28

7、8可以顯著降低ERK/MAPK通路的表達水平，增加P38/MAPK通路的表達水平，增加了JNK/SAPK通路的表達水平。根據(jù)這些實驗結果，我們推測HD-ZWM-288的抑制耐藥細胞生長活性與其調節(jié)的這些蛋白激酶有關。
　　MDR1啟動子區(qū)域存在著NF-κB的結合序列，NF-κB能夠激活連接MDR1啟動子的基因轉錄。AKT是NF-κB的上游信號，可以調控NF-κB的表達。在本研究中，HD-ZWM-288可以顯著抑制AKT的磷酸化，增

8、加IκBα的表達，進而降氐NF-κB的磷酸化。這些實驗結果表明，AKT/NF-κB信號通路也參與了HD-ZWM-288引起的P-gp的表達降低。
　　在本實驗中我們發(fā)現(xiàn)HD-ZWM-288在細胞發(fā)生明顯的凋亡之前可以引起明顯的G2/M期阻滯。為了驗證ROS是否參與HD-ZWM-288引起的細胞周期阻滯，我們用ROS清除劑NAC提前處理細胞。結果顯示，在NAC的作用下，可以逆轉HD-ZWM-288引起的G2/M期阻滯。以上這些實驗結

9、果說明，ROS是也參與HD-ZWM-288引起的細胞周期阻滯。
　　綜上所述，HD-ZWM-288具有較好的抗腫瘤多藥耐藥作用。在HD-ZWM-288的作用下，細胞內ROS水平升高，一方面降低Bcl-2的表達，激活Bax蛋白家族，從而使線粒體膜電位下降，線粒體膜破裂，細胞色素C釋放，進而引起細胞凋亡。另一方面通過作用于MAPK和AKT/NF-κB信號通路，抑制P-gp的表達，進而增加細胞內藥物積累量，引起細胞凋亡。同時HD-ZWM