環(huán)酰亞胺類肽候選藥物24F(CIP-13F)抗腫瘤作用研究.pdf

1、研究背景:腫瘤細(xì)胞高表達(dá)氨肽酶N(APN/CD13)并降解細(xì)胞外基質(zhì),促進(jìn)癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移,APN/CD13是藥物設(shè)計(jì)與治療的重要靶酶?；贏PN/CD13結(jié)構(gòu)特點(diǎn),我們?cè)O(shè)計(jì)合成了多系列的環(huán)酰亞胺小分子類肽化合物。通過篩選,發(fā)現(xiàn)化合物24F(或稱CIP-13F)具有較高活性,具有繼續(xù)研究成為創(chuàng)新性藥物的價(jià)值。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:以L-亮氨酸對(duì)硝基苯胺底物法分析24F對(duì)腫瘤細(xì)胞APN/CD13酶活性的抑制作用;分別以免疫流式細(xì)胞術(shù)和

2、Western blotting法檢測APN/CD13表達(dá)水平;以MTT法評(píng)價(jià)24F對(duì)癌細(xì)胞增殖抑制作用;以transwell chamber法觀察24F對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和游走能力抑制作用;以裸鼠移植人卵巢癌細(xì)胞ES-2模型,尾靜脈注射給藥評(píng)價(jià)24F的抗腫瘤活性。分別以Hoechst33258染色法、Annexin V/PI法檢測24F對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡作用;以Western blotting法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平,包括cleaved c

3、aspase-3和cleaved PARP(polyADP-ribose polymerase);以碘化丙啶染色流式細(xì)胞術(shù)法評(píng)價(jià)24F對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖周期的影響;以Western blotting法測定了24F對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)皮生長因子VEGF的抑制作用。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:24F對(duì)高表達(dá)APN/CD13的白血病細(xì)胞HL-60和卵巢癌細(xì)胞ES-2APN/CD13活性抑制作用較強(qiáng),以500μmol/L劑量孵育60min,其抑制率分別為52

4、.5％和61.7％。24F對(duì)低表達(dá)APN/CD13的SKOV3,PLC/PRF/5和ECV304細(xì)胞表面酶活性抑制作用較弱。24F對(duì)體外生長的HL-60和ES-2細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用,并明顯抑制ES-2細(xì)胞穿過人工基底膜能力。24F對(duì)裸鼠體內(nèi)生長的ES-2腫瘤具有較強(qiáng)的抑制作用,分別以10,50mg/kg劑量尾靜脈注射給藥2周,對(duì)腫瘤生長抑制率分別為31.0％和38.0％。以Westernblotting及流式細(xì)胞術(shù)檢測24F對(duì)

5、腫瘤細(xì)胞APN/CD13表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)24F對(duì)體內(nèi)生長的ES-2腫瘤組織APN/CD13表達(dá)抑制作用較強(qiáng)。24F誘導(dǎo)ES-2和HL-60細(xì)胞凋亡,熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)典型細(xì)胞凋亡形態(tài),流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)其凋亡比例增加,其作用機(jī)制可能與其誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3和cleaved PARP水平升高有關(guān)。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn),24F能使HL-60細(xì)胞停滯于G0/G1期,阻止細(xì)胞進(jìn)入G2/M期。另外,Western b