家蠶絲氨酸蛋白酶BmSP142在抗病毒侵染中的作用.pdf

1、昆蟲先天免疫系統(tǒng)包括細(xì)胞免疫和體液免疫，細(xì)胞免疫主要是通過昆蟲血液中的漿細(xì)胞對入侵的微生物進(jìn)行吞噬，而昆蟲的體液免疫比較復(fù)雜，涉及到昆蟲體內(nèi)許多蛋白質(zhì)間的相互作用，其中絲氨酸蛋白酶及其同源物在食物消化、胚胎發(fā)育和先天免疫等方面具有重要作用。根據(jù)研究報(bào)道，家蠶基因組中含有143個(gè)絲氨酸蛋白酶編碼基因，分別編碼51個(gè)絲氨酸蛋白酶和92個(gè)絲氨酸蛋白酶同源物，然而到目前為止，對于這些這些蛋白酶的具體功能和作用機(jī)制還不甚清楚。
　　本課題以

2、家蠶絲氨酸蛋白酶BmSP142為研究對象，對其進(jìn)行序列分析和表達(dá)特征分析；利用原核表達(dá)系統(tǒng)對其進(jìn)行表達(dá)并純化到其可溶性靶蛋白，體外對其絲氨酸蛋白酶活性進(jìn)行分析；利用純化的BmSP142免疫小鼠獲得其多克隆抗體；通過qPCR和制備的多抗分別對BmSP142進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)相和表達(dá)時(shí)相分析；最后對家蠶體內(nèi)和細(xì)胞水平上闡明BmSP142蛋白在抗病毒侵染和增殖中的具體作用。進(jìn)而為深入了解家蠶先天免疫系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。本研究論文主要結(jié)果如下：
　　1

3、.生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，家蠶絲氨酸蛋白酶BmSP142中1-22位氨基酸為信號肽序列，能夠指導(dǎo)蛋白向胞外分泌；同時(shí)，該蛋白具有類胰蛋白酶的絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域（Trypsin-like serine protease），該結(jié)構(gòu)域中具有絲氨酸蛋白酶特有的三聯(lián)體催化中心H(His)-Asp(D)-Ser(S)。組織分布結(jié)果表明：BmSP142特異性地表達(dá)于家蠶中腸中，且多表達(dá)在家蠶中腸中部。這些序列分析結(jié)果為后續(xù)相關(guān)功能研究提供了方向和基礎(chǔ)。<

4、br>　　2.構(gòu)建融合有GST標(biāo)簽的BmSP142重組表達(dá)質(zhì)粒，對其進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá)，獲得可溶性的重組蛋白；對純化的可溶性重組蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定及后續(xù)的酶活性分析；同時(shí)用重組表達(dá)產(chǎn)物免疫小鼠，制備其多克隆抗體，為該蛋白后續(xù)相關(guān)研究提供材料。
　　3.轉(zhuǎn)錄時(shí)相分析結(jié)果顯示：與健康家蠶中腸組織中BmSP142基因的表達(dá)量相比，BmBDV病毒感染的家蠶中腸中該基因表達(dá)量呈明顯上調(diào)趨勢，而BmNPV病毒感染后的家蠶中腸中該基因表達(dá)量呈下調(diào)趨

5、勢；而抗性品系798家蠶口服BmBDV病毒24 h后、以及抗性品系NB家蠶口服BmNPV病毒24小時(shí)后，qPCR結(jié)果表明：病毒感染24 h后，抗性品系家蠶中腸組織中的BmSP142基因表達(dá)量急劇上升，病毒感染的易感品性家蠶306和華八三五中BmSP142表達(dá)水平很低。BmSP142基因在病毒感染后RNA水平上調(diào)暗示了，家蠶絲氨酸蛋白酶BmSP142在抵抗病毒侵染和增殖中發(fā)揮著一定的作用。
　　4.將純化獲得的、具有生物學(xué)活性的家蠶

6、絲氨酸蛋白酶 BmSP142分別與BmBDV病毒粒子以及BmNPV病毒粒子共同孵育后，用孵育混合物感染家蠶，感染后提取家蠶中腸組織中總DNA，通過qPCR檢測病毒DNA的復(fù)制情況。同時(shí)對未經(jīng)BmSP142處理的病毒粒子感染后的家蠶中病毒拷貝進(jìn)行檢測，結(jié)果表明： BmSP142共孵育的病毒粒子感染家蠶后，其病毒拷貝數(shù)明顯低于未處理組感染的家蠶中腸中的病毒拷貝。隨后，將攜帶熒光標(biāo)簽的BmNPV病毒粒子與BmSP142共孵育后，感染家蠶BmN

7、細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示：隨著與病毒孵育的家蠶絲氨酸蛋白酶BmSP142量的增加，其所感染的細(xì)胞中熒光數(shù)量越來越少。另外，將瞬時(shí)表達(dá) BmSP142的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 BmN細(xì)胞，將攜帶綠色熒光標(biāo)記的重組BmNPV病毒對轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞進(jìn)行感染，對感染后的細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)時(shí)間點(diǎn)熒光顯微觀察，其熒光數(shù)量明顯少于未轉(zhuǎn)染BmSP142瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞中的熒光數(shù)量，該結(jié)果表明：BmSP142能夠有效地抑制病毒的增殖。
　　上述研究結(jié)果表