以流感病毒神經(jīng)氨酸酶和丙型肝炎病毒NS3-4A蛋白酶為靶點(diǎn)的抗病毒先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn).pdf

1、流感是由流感病毒引起的急性上呼吸道傳染病，每年都會(huì)造成幾十萬人的死亡，是人類生命健康的一大威脅。近年來，由于流感病毒的不斷變異，人感染高致病性禽流感病毒如H5N1、H7N9等病例的頻繁出現(xiàn)造成了極大的社會(huì)恐慌，耐藥病毒株的出現(xiàn)使目前的抗流感病毒形勢更加嚴(yán)峻。神經(jīng)氨酸酶(NA)是位于流感病毒表面的重要糖蛋白，在病毒感染時(shí)可以水解宿主細(xì)胞表面的唾液酸與糖蛋白之間糖苷鍵促使病毒釋放，同時(shí)可以防止子代病毒富集。NA還可以水解呼吸道黏膜中的唾液酸

2、，促進(jìn)病毒在呼吸道中的傳播，在病毒的復(fù)制和感染周期中發(fā)揮了重要作用。NA雖然亞型眾多，但其活性位點(diǎn)的十幾個(gè)氨基酸卻在所有甲型和乙型流感病毒中高度保守，是NA抑制劑設(shè)計(jì)的重要理論基礎(chǔ)。
　　扎那米韋（zanamivir）和奧司他韋(oseltamivir)上市以來，NA抑制劑成為抗流感病毒的重要措施，先后又有帕拉米韋（peramivir）和拉尼米韋(Laninamivir)在幾個(gè)國家上市。NA也成為抗流感病毒藥物設(shè)計(jì)的重要靶點(diǎn)，人們

3、設(shè)計(jì)、合成了多種結(jié)構(gòu)類型的NA抑制劑，還有很多天然產(chǎn)物分子被報(bào)道也具有一定的NA抑制活性。
　　近年來，由于NA抑制藥物廣泛應(yīng)用于臨床，已經(jīng)有耐藥病毒株出現(xiàn)，oseltamivir由于是口服制劑，應(yīng)用最為廣泛，但病毒耐藥性也最為嚴(yán)重。Zanamivir和peramivir也有耐藥病毒株開始出現(xiàn)。因此，開發(fā)新型、高效、安全的NA抑制劑仍是目前抗流感病毒領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
　　丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的，可發(fā)展為慢性

4、肝炎、肝硬化及肝癌等嚴(yán)重的肝臟疾病。全球已有約1.8億人感染了HCV，每年會(huì)引起幾十萬人的死亡，是人類健康的又一大威脅。目前尚無疫苗可以有效的預(yù)防HCV感染。NS3/4A是HCV的重要功能蛋白，具有絲氨酸蛋白酶活性，可以水解HCV的多聚蛋白前體形成成熟的NS3～NS5B蛋白，在病毒的復(fù)制和感染周期中發(fā)揮了重要作用。NS3/4A是抗HCV藥物設(shè)計(jì)的重要靶點(diǎn)，從NS3/4A蛋白酶抑制劑博賽匹韋(boceprevir)或特拉匹韋(telapr

5、evir)與干擾素聯(lián)合利巴韋林的三聯(lián)治療在美國被批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床后，越來越多的NS3/4A蛋白酶抑制劑被相繼報(bào)道出來，已有多個(gè)化合物處于臨床研究階段。由于第一代抑制劑的副作用和耐藥性問題，開發(fā)安全、有效的新型NS3/4A蛋白酶抑制劑已經(jīng)迫在眉睫。
　　研究方法:
　　本研究主要包括兩個(gè)部分的內(nèi)容:
　　第一部分 流感病毒NA抑制劑:我們設(shè)計(jì)的NA抑制劑共有兩類，第一類為查耳酮類非經(jīng)典NA抑制劑。很多天然產(chǎn)物被報(bào)道具有NA

6、抑制活性，我們以課題組前期建立的黃酮類NA抑制劑藥效團(tuán)模型為基礎(chǔ)，通過基于配體的藥物設(shè)計(jì)方法，以2，4-二氨基苯酚為基本結(jié)構(gòu)片段進(jìn)行化合物設(shè)計(jì)。首先通過酰胺鍵在C-4位引入芳香基取代的β-丙烯酸側(cè)鏈，并對苯環(huán)上的取代基進(jìn)行了改造，其次，在C-2位引入烷酰胺及芳香酰胺側(cè)鏈，設(shè)計(jì)了系列具有查耳酮類似骨架的非經(jīng)典NA抑制劑。第二類為苯乙酸類NA抑制劑。流感病毒NA的晶體結(jié)構(gòu)及其活性位點(diǎn)的主要氨基酸構(gòu)成已經(jīng)被闡明，我們在此基礎(chǔ)上通過基于結(jié)構(gòu)的藥

7、物設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)、合成了系列苯乙酸類NA抑制劑。苯環(huán)的剛性結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是限制其活性的主要因素，因此我們選用苯乙酸骨架增加骨架柔性，采用與活性較好的苯甲酸類抑制劑相似的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)及位置，以2-（3，4-二氨基苯基）乙酸為結(jié)構(gòu)片段合成了B系列化合物，并將其C-3位氨基烷基化引入疏水側(cè)鏈，以期可以結(jié)合增加抑制劑的選擇性。
　　第二部分 HCV NS3/4A蛋白酶抑制劑:我們以HCV NS3/4A蛋白酶為靶點(diǎn)，通過文獻(xiàn)調(diào)研確定采用類似于NS3/

8、4A蛋白酶內(nèi)切割產(chǎn)物的直鏈多肽為骨架，以酰基磺酰胺基為基本藥效基團(tuán)，對P2位置采用了與其他抑制劑不同的S構(gòu)型三氮唑及酰胺鍵為連接基團(tuán)，其他位置采用不同的氨基酸側(cè)鏈，設(shè)計(jì)、合成了系列NS3/4A蛋白酶抑制劑。
　　研究結(jié)果:
　　本論文以文獻(xiàn)報(bào)道的活性篩選方法對兩個(gè)系列的流感病毒NA抑制劑和一個(gè)系列的HCV NS3/4A蛋白酶抑制劑進(jìn)行了活性篩選。第一部分流感病毒NA抑制劑活性測試結(jié)果顯示，我們合成的化合物均有一定的NA抑制活

9、性。查耳酮類似物系列NA抑制劑雖然化合物的整體活性較差，但是活性最好的兩個(gè)化合物(A5)和(A13)仍然可以作為先導(dǎo)化合物進(jìn)行改造，對此類抑制劑的開發(fā)具有指導(dǎo)意義。苯乙酸類NA抑制劑的活性測試結(jié)果顯示該系列化合物的活性比上個(gè)系列整體上有明顯提高，活性最好的是化合物(B9)。該系列氨基烷基化的幾個(gè)化合物均表現(xiàn)出了一定的NA亞型選擇性，(B9)的選擇性最好，對H5N1的活性比H9N2高10倍以上。第二部分HCV NS3/4A蛋白酶抑制劑的活

10、性結(jié)果顯示，該系列化合物的NS3/4A蛋白酶抑制活性較好，活性最好的是化合物(C1)和(E3)。另外，我們利用SYBYLX-2.0軟件對合成的化合物進(jìn)行了構(gòu)效關(guān)系研究，探討了三個(gè)系列化合物與各自酶活性區(qū)域的作用模式。研究結(jié)論與意義:
　　本研究開展了以流感病毒神經(jīng)氨酸酶和丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶為靶點(diǎn)的化合物設(shè)計(jì)、合成和初步活性研究。查耳酮類的流感病毒NA抑制劑雖然整體活性不強(qiáng)，但對其構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了研究討論，對今后此類NA抑