導(dǎo)入端粒酶延長正?？谇徽衬そ腔?xì)胞壽命研究.pdf

1、上海第二醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文導(dǎo)入端粒酶延長正?？谇徽衬そ腔?xì)胞壽命研究姓名：周海文申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：口腔臨床醫(yī)學(xué)（口腔內(nèi)科學(xué)）指導(dǎo)教師：周曾同2003.4.1刷海文上海第二醫(yī)科火學(xué)博士學(xué)位論文(2003年)中文摘要目的：建立一個(gè)穩(wěn)定的人正?？谇徽衬そ腔?xì)胞體外培養(yǎng)體系；將端粒酶導(dǎo)入人正常口腔粘膜角化細(xì)胞延長細(xì)胞壽命，為口腔粘膜癌前病變的細(xì)胞模型研究奠定基礎(chǔ)。方法：比較傳統(tǒng)組織塊培養(yǎng)、改良組織塊培養(yǎng)、酶消化培養(yǎng)法，從中建立穩(wěn)定的人正

2、?？谇徽衬そ腔?xì)胞體外培養(yǎng)體系；通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)、超微結(jié)構(gòu)觀察及角蛋白免疫組化染色等對細(xì)胞進(jìn)行定性研究；通過測定細(xì)胞生長曲線及克隆形成率了解細(xì)胞生長基本規(guī)律及其增殖能力；經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞染色體倍性；通過亞克隆方法構(gòu)建重組pEGFP—hTRT質(zhì)粒載體，經(jīng)電泳及測序鑒定，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后熒光觀察，RT—PCR檢測外源性端粒酶表達(dá)了解新構(gòu)質(zhì)粒能否在真核細(xì)胞中表達(dá)；采用脂質(zhì)體介導(dǎo)pEGFP—hTRT轉(zhuǎn)染OKg，優(yōu)化轉(zhuǎn)染體系，激光共聚焦顯微鏡觀

3、察轉(zhuǎn)染結(jié)果：采用pBABE—tert重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染OKC，RT—PCR檢測外源性端粒酶，并檢測端粒酶活性；通過細(xì)胞生物學(xué)一般性狀：包括細(xì)胞形態(tài)、生長速度和倍增時(shí)間及染色體倍性、B半乳糖苷酶染色細(xì)胞衰老研究、軟瓊脂培養(yǎng)、裸鼠接種致瘤試驗(yàn)比較轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞生物學(xué)性狀。結(jié)果：采用Dispase酶及胰蛋白酶消化法，用無血清角化細(xì)胞培養(yǎng)液，在無3T3細(xì)胞的條件下可成功地進(jìn)行人正常口腔粘膜角化細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)，細(xì)胞可傳45代，存活30一50天；培

4、養(yǎng)細(xì)胞具有上皮細(xì)胞的典型形態(tài)，細(xì)胞呈多角形，具有豐富的橋粒及大量張力絲等特征性超微結(jié)構(gòu)，角蛋白染色陽性；細(xì)胞接種后第卜3天為靜止生長期，第5—10天處于對數(shù)生長期，第12天后進(jìn)入平臺(tái)期，倍增時(shí)間為24—48小時(shí)；接種密度為200個(gè)細(xì)胞／c砰時(shí)，培養(yǎng)細(xì)胞克隆形成率為0979％；原代及傳代細(xì)胞均為二倍體細(xì)胞；重組pEGFPhTRT質(zhì)粒載體經(jīng)電泳及測序比對序列正確；轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后熒光顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡觀察可見綠色熒光在細(xì)胞核中表達(dá)；R