人腫瘤內(nèi)皮標(biāo)記物8(TEM8)SV3重組異型體的構(gòu)建及特點(diǎn)研究.pdf

1、本文以人與鼠的腫瘤內(nèi)皮標(biāo)記物8(TEM8)SV3蛋白質(zhì)中存在96％氨基酸同源性為依據(jù)，應(yīng)用前期鼠腫瘤內(nèi)皮標(biāo)記物8(TEM8) SV3重組蛋白質(zhì)的有關(guān)數(shù)據(jù)，針對(duì)人腫瘤內(nèi)皮標(biāo)記物8(TEM8) SV3重組蛋白的構(gòu)建，對(duì)其特點(diǎn)進(jìn)行深入研究，進(jìn)而為后續(xù)外源人體腫瘤內(nèi)皮標(biāo)記物8(TEM8)抗原免疫小鼠做好前期準(zhǔn)備。 在本研究中，我們以已知人乳腺癌細(xì)胞系腫瘤內(nèi)皮標(biāo)記物8(TEM8) SV3 DNA為模板、設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增從而得到所需

2、的DNA。應(yīng)用GATEWAY克隆技術(shù)，構(gòu)建克隆載體對(duì)其進(jìn)行兩步克?。篖R反應(yīng)--進(jìn)入克隆與BP反應(yīng)--表達(dá)克隆，得到我們所需要的重組DNA。在表達(dá)克隆過(guò)程中，我們應(yīng)用了兩種不同的感受態(tài)細(xì)胞Ecoli.DH5α和BL21 StarTM(DE3)，對(duì)在不同的感受態(tài)細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果進(jìn)行分析、優(yōu)化表達(dá)條件，然后將所得到的重組DNA結(jié)果進(jìn)行測(cè)序、篩選，選擇同源性較高序列的DNA，進(jìn)行蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)。在蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程中，我們同樣進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)間

3、(3小時(shí)與5小時(shí))、誘導(dǎo)試劑(NaCl與IPTG)及表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞(E coli.DH5α和BL21StarTM(DE3))等誘導(dǎo)因素的篩選，然后將誘導(dǎo)效果較好的重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行蛋白質(zhì)的提取，最后我們將誘導(dǎo)產(chǎn)物進(jìn)行了初步純化，并應(yīng)用商用抗TEM8抗體做了Western雜交，得到以下結(jié)論： 1.我們首先得到了分子量為1000bp的人腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物8(TEM8) SV3 DNA。 2.在誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，感受態(tài)細(xì)胞在克隆過(guò)

4、程與誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程中都起了極其重要的作用。在克隆過(guò)程中，由于感受態(tài)細(xì)胞E coli.DH5α不耐受T7 DNA聚合酶，同時(shí)維持其體內(nèi)的構(gòu)建條件，導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物DNA的濃度低、RNA污染嚴(yán)重等。誘導(dǎo)表達(dá)也受到同樣的干擾，使得在誘導(dǎo)后的重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物中得不到所需的表達(dá)蛋白。 3.從誘導(dǎo)表達(dá)的篩選中得到，對(duì)人腫瘤內(nèi)皮標(biāo)記物8(TEM8)SV3蛋白質(zhì)的初步適宜的誘導(dǎo)條件為：以BL21 StarTM(DE3)為感受態(tài)細(xì)胞，IPTG為誘導(dǎo)試劑，