葡萄糖神經(jīng)酰胺合成酶抑制劑聯(lián)合漢防己甲素逆轉(zhuǎn)K562-A02細(xì)胞耐藥性的研究.pdf

1、目的：本課題旨在研究聯(lián)合應(yīng)用葡萄糖神經(jīng)酰胺合成酶抑制劑D，L-threo-1-phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol（PDMP）和漢防己甲素（tetrandrine，Tet）逆轉(zhuǎn)K562/A02細(xì)胞柔紅霉素（daunorubicin，DNR）耐藥，并測定葡萄糖神經(jīng)酰胺合成酶（glucosylceramide synthase，GCS）和多藥耐藥基因1（multidrug resist

2、ance genel，mdrl）的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)情況，以探討藥物逆轉(zhuǎn)多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）的可能機(jī)制，為臨床白血病的治療提供一定的理論依據(jù)。
　　 方法：（1）采用甲基四唑藍(lán)法（MTT）檢測PDMP、DNR、PDMP+DNR、Tet+DNR、DNR+PDMP+Tet分別作用于K562/A02細(xì)胞和K562細(xì)胞48小時(shí)后對(duì)細(xì)胞增殖的影響，計(jì)算出其半數(shù)抑制量（the half maximal inh

3、ibitory concentration，IC50）和逆轉(zhuǎn)倍數(shù)（foldreversal，F(xiàn)R）；（2）采用流式細(xì)胞儀（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測PDMP、Tet、PDMP+Tet分別與0.51μg/ml DNR聯(lián)用對(duì)K562/A02細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞內(nèi)DNR濃度的影響；（3）采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）測定PDMP

4、、Tet及兩藥聯(lián)合作用于細(xì)胞48小時(shí)后，mdrl mRNA、GCS mRNA表達(dá)變化。（4）采用Western blot測定PDMP、Tet及兩藥聯(lián)合作用于細(xì)胞48小時(shí)后，P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、GCS水平變化。
　　 結(jié)果：（1）PDMP≤20μmol/l對(duì)K562及K562/A02細(xì)胞株無明顯生長抑制作用（細(xì)胞增殖抑制率<10％），選擇20μmol/l PDMP作為逆轉(zhuǎn)劑濃度；（2）20μmol

5、/l PDMP或1μmol/lTet能增加K562/A02細(xì)胞對(duì)DNR的敏感性，兩種逆轉(zhuǎn)劑聯(lián)用時(shí)效果更明顯。DNR對(duì)K562和K562/A02細(xì)胞的IC50分別為（0.234±0.02）μg/ml和（7.064±0.53）μg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；DNR分別聯(lián)合PDMP或Tet，以及三藥聯(lián)合作用K562/A02細(xì)胞48小時(shí)后，對(duì)K562/A02的IC50分別為（2.924±0.24）μg/ml、（1.53±0.17）

6、μg/ml和（0.69±0.03）μg/ml，F(xiàn)R分別為2.42、4.61和10.23倍；但PDMP或Tet聯(lián)合DNR以及三藥聯(lián)用對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響與未加逆轉(zhuǎn)劑組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）（IC50分別為（0.25±0.02），（0.22±0.01）和（0.21±0.01）μg/ml）。（3）FCM檢測顯示①對(duì)照組K562/A02細(xì)胞48小時(shí)凋亡率為（2.11±0.35）％；0.5μg/ml DNR單獨(dú)作用于K562/

7、A02細(xì)胞凋亡率為（5.43±0.70）％；DNR分別聯(lián)合20μmol/l PDMP和1μmol/l Tet，以及三藥聯(lián)合時(shí)，K562/A02細(xì)胞凋亡率分別為（18.06±1.46）％、（21.93±1.98）％和（42.77±2.32）％；②0.5μg/ml DNR單獨(dú)作用于K562/A02細(xì)胞48小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)DNR平均熒光強(qiáng)度為1554.67±91.09，DNR分別聯(lián)合20μmol/l PDMP、1μmol/l Tet及三藥聯(lián)合處

8、理K562/A02細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)DNR平均熒光強(qiáng)度分別為1975.33±111.54、2069.67±118.29和4435.33±151.13，不同處理組細(xì)胞內(nèi)DNR濃度的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。（3）RT-PCR和Western blot檢測顯示①K562細(xì)胞mdrl和GCS基因在mRNA和蛋白水平呈低表達(dá)，兩種基因均在K562/A02細(xì)胞呈高表達(dá)；20μmol/l PDMP能下調(diào)K562/A02細(xì)胞內(nèi)GCS基因的表達(dá)，T

9、et能下調(diào)K562/A02細(xì)胞內(nèi)mdrl基因的表達(dá)，聯(lián)合用藥對(duì)兩種基因的表達(dá)下調(diào)效果更明顯（p<0.05）；②PDMP能抑制mdrl基因的表達(dá)而Tet也能下調(diào)GCSmRNA和蛋白含量。
　　 結(jié)論：（1）20μmol/l及以下濃度的PDMP對(duì)K562及K562/A02細(xì)胞株無明顯細(xì)胞毒性；（2）PDMP和Tet均能提高K562/A02細(xì)胞對(duì)DNR的敏感性，增加細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，當(dāng)兩藥聯(lián)合時(shí)效果更明顯；（3）PDMP能下