致病性大腸桿菌致細胞線粒體功能障礙和粘附脫落損傷效應分子作用研究.pdf

1、目的： 1、探討致病性大腸桿菌（EPEC）感染宿主上皮細胞后，效應分子EspH的轉位、分布以及在EPEC致宿主細胞粘附、脫落損傷（A/E）中的作用。 2、探討EPEC感染Hela細胞后，效應分子在EPEC致Hela細胞線粒體功能障礙中的作用。 3、探討EPEC感染TC-7細胞，參與細菌粘附及引起腸上皮細胞微絨毛脫落損傷的效應分子。 方法： 1、分別用PCR方法擴增espH基因緊鄰上游DNA片段（約

2、500 bp）、卡那霉素開放讀碼框（約1200 bp）和espH基因下游DNA片段（約500 bp），按順序把三個DNA片段串聯(lián)克隆到PCR克隆載體pSC-A中，再亞克隆該大片段（約2200bp）到自殺質粒pCVD442中得到自殺質粒pCVD442-△espH：：kana，通過結合傳遞、等位交換，抗性篩選制備EPEC△espH刪除株，并對刪除株進行PCR鑒定和相應染色體DNA區(qū)段做測序鑒定；構建帶HA標簽的EspH表達載體pTrc99a

3、-EspH：HA，電轉化載體到△espH刪除株制備△espH/pTrc99a-EspH：HA，并用其感染Hela細胞，Western Blot和免疫熒光技術檢測EspH的轉位以及轉位后EspH的分布；構建EspH和增強型綠色熒光蛋白（EGFP）融合表達質粒pEspH-EGFP，轉染Hela細胞，熒光顯微鏡觀察融合蛋白的分布；并用△espH刪除株感染Hela、Caco-2和TC-7細胞，分別用熒光顯微鏡技術，跨上皮細胞電阻（TER）檢測和

4、掃描電子顯微鏡（SEM）技術探討EspH在基墊形成，屏障功能障礙和微絨毛脫落損傷中的作用。 2、通過結合傳遞、等位交換，抗性篩選制備△espF、△map、△map espF等刪除株，并用PCR和Western Blot對刪除株進行鑒定；用制備的刪除株和其他效應分子刪除株、質粒表達相應效應分子互補株或染色體表達效應分子互補株感染經用線粒體膜電位試劑盒JC-1染色的Hela細胞，并用多功能酶標儀檢測感染前后線粒體膜電位（MMP）的改

5、變，Western Blot和免疫熒光技術檢測效應分子的轉位及分布，從而探索效應分子在EPEC致線粒體功能障礙中的作用及可能機制。 3、分別用EPEC野生型、Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS）刪除株△cfm-14、束狀菌毛（BFP）刪除株△bfpA以及其他效應分子刪除株感染經極化培養(yǎng)的TC-7細胞，通過掃描電鏡檢測參與A/E損傷的效應分子，并用質粒表達相應蛋白互補刪除株，證實效應分子在A/E損傷中的作用。 結果： 1、酶切

6、、測序及PCR鑒定表明自殺質粒pCVD442-△espH：：kana成功構建；PCR和測序鑒定表明：△espH刪除株構建成功，卡那霉素基因取代espH基因，且△espH刪除株獲得卡那霉素抗性；感染Hela細胞以后，對細胞組分分離，Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)：EspH依賴于T3SS轉位到宿主細胞，并在細胞Tritonx-100可溶性組分中檢測到表達，免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)EspH分布于細胞膜，基墊形成處；轉染實驗發(fā)現(xiàn)EspH與EGFP融合

7、蛋白分布于細胞膜，且轉染的細胞變成球形；感染實驗發(fā)現(xiàn)：△espH刪除株能有效誘導基墊形成，其降低Caco-2細胞屏障功能的能力和造成TC-7細胞微絨毛脫落損傷能力與EPEC野生型相似。 2、PCR和Western Blot證實：△map、△espF和△map espF等刪除株構建成功，MMP檢測發(fā)現(xiàn)：與EPEC野生型相比，△map和△espF刪除株降低線粒體膜電位功能減弱（P<0.05），△map espF雙刪除株功能較△map

8、或△espF進一步減弱（P<0.05），但△map espF功能較T3SS刪除株△cfm-14強大（P<0.05），而且，刪除株缺失功能能被質粒表達相應蛋白互補，并且，定位于細胞質的突變體EspFL16E也能互補刪除株的功能。對△eae和△tir刪除株的檢測發(fā)現(xiàn)：其降低MMP功能較野生型顯著減弱（P<0.05），△eae刪除株可以被質粒表達intimin互補，但是△tir不能被質粒表達Tir所互補，但可以被染色體表達野生型Tir和突變T

9、irY474S所互補，而不能被染色體表達突變TirS434A互補；而△espG和△espH降低MMP能力與野生型比較無顯著性差異，但△espZ刪除株具有比野生型更強大的功能（P<0.05），Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)：△espZ刪除株轉位的Tir蛋白具有不同的磷酸化修飾遷移條帶。 3、EPEC野生型感染TC-7細胞，最先細菌呈局限性粘附，菌落呈三維球狀，隨后可見有大量細菌緊密粘附在細胞表面，菌落致密平坦，并可見大量微絨毛脫

10、落；BFP刪除株△bfpA感染后只有個別細菌粘附，細胞微絨毛完好；而T3SS刪除株△cfm-14感染細胞以后，雖有大量細菌粘附，但細菌成局限性粘附，且只見微絨毛紊亂，未見微絨毛脫落損傷；外膜蛋白intimin刪除株（△eae）和其受體Tir刪除株（△tir）感染后，可見細菌皆呈局限性粘附，微絨毛大量脫落，但質?；パa表達相應效應分子以后，恢復刪除株到野生型相似表型：而用△espF或△map espF雙刪除株感染后，有大量細菌粘附，細菌下陷

11、入微絨毛叢，但是微絨毛脫落損傷輕微，質粒表達EspF互補△espF刪除株后，恢復刪除株到野生型相似表型。 結論： 1、EspH是EPEC毒力島基因LEE編碼的一個依耐T3SS轉位的效應分子，轉位以后，蛋白分布于細胞膜，基墊形成處，且對轉染細胞有一定毒性，但未發(fā)現(xiàn)EspH在EPEC基墊形成、屏障功能障礙和微絨毛脫落方面具有重要作用。 2、EPEC感染Hela細胞，效應分子Map和EspF可以單獨并協(xié)同地引起線粒體功