群感分子AI-2調(diào)控奶牛源致病性大腸桿菌耐藥性的分子機(jī)制.pdf

1、奶牛乳腺炎是奶牛最常見的多發(fā)性疾病之一，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，大多使用抗菌藥物對奶牛乳腺炎進(jìn)行防治，但是由于抗菌藥物的長期使用乃至濫用，導(dǎo)致了奶牛乳腺炎致病菌的耐藥性不斷增強(qiáng)，成為奶牛養(yǎng)殖業(yè)面臨的重要難題。導(dǎo)致奶牛乳腺炎的主要病原菌是金黃色葡萄球菌，大腸桿菌和鏈球菌。近年來，對金黃色葡萄球菌和鏈球菌導(dǎo)致奶牛乳腺炎的致病機(jī)制的報(bào)道較多，關(guān)于奶牛乳腺炎大腸桿菌臨床分離株致病機(jī)制和耐藥機(jī)制的研究則相對較少。群體感應(yīng)系統(tǒng)是細(xì)菌

2、為適應(yīng)某些特殊環(huán)境利用自身產(chǎn)生的化學(xué)分子作為信號通訊去改變其生理行為的過程。群體感應(yīng)信號分子 AI-2被認(rèn)為是廣泛存在于革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌中的種間通訊信號。在大腸桿菌模式株中，AI-2的調(diào)控機(jī)制研究較多。但是，在臨床致病性大腸桿菌中，AI-2對大腸桿菌耐藥基因及其相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究國內(nèi)外鮮有報(bào)道。
　　本研究旨在通過對群體感應(yīng)信號分子 AI-2對奶牛乳腺炎大腸桿菌臨床分離株耐藥性的調(diào)控機(jī)制的研究，從而為控制奶牛乳

3、腺炎疾病的產(chǎn)生提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　1.為了檢測奶牛乳腺炎大腸桿菌臨床分離株的耐藥性，本研究利用二倍稀釋法和梯度稀釋法檢測了奶牛乳腺炎E. coli DCM1臨床分離株對多種抗菌藥物的耐藥性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該菌株對氨芐青霉素、苯唑西林、青霉素 G和氯霉素的最小抑菌濃度分別為4.5 mg/mL、6.5 mg/mL、3.5 mg/mL和2.0μg/mL，表明該菌株為典型的青霉素類多重耐藥大腸桿菌。
　　2.利用PCR擴(kuò)增技術(shù)和特異性酶

4、切圖譜檢測大腸桿菌的耐藥基因以及耐藥基因與轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒的位置關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明，質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因tem編碼超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs），以及超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）陽性大腸桿菌是導(dǎo)致奶牛乳腺炎的主要原因。
　　3.本研究利用菌落計(jì)數(shù)法和比濁法通過添加外源的AI-2檢測其對大腸桿菌生長的影響，結(jié)果表明，外源添加AI-2可使E. coli DCM1的耐藥性增強(qiáng)。
　　4.本研究利用實(shí)時熒光定量 PCR（RT-qPCR）技

5、術(shù)檢測耐藥基因 tem的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，氨芐青霉素、苯唑西林和青霉素G的壓力下，添加外源的AI-2會導(dǎo)致tem基因的轉(zhuǎn)錄水平分別提高2.1倍，2.4倍和2.4倍。
　　5.通過過表達(dá) AI-2胞內(nèi)受體 LsrR蛋白并將其純化后利用凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)，使不同量的LsrR蛋白與tem啟動子區(qū)域特異性結(jié)合，結(jié)果表明，外源添加AI-2通過LsrR蛋白間接地上調(diào) tem的轉(zhuǎn)錄水平。因此,本研究結(jié)果證明了外源添加 AI-2通過上調(diào)tem的表達(dá)增