禽致病性大腸桿菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)2核心組分VgrG致病作用及調(diào)控研究.pdf

1、禽大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌（Avian Pathogenic Escherichia coli，APEC）引起的以氣囊炎、關(guān)節(jié)滑膜炎、輸卵管炎和腹膜炎為主要特征的傳染病。禽致病性大腸桿菌常與其它病原混合感染或繼發(fā)感染，從而加重病情，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
　　分泌系統(tǒng)可將細(xì)菌蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)菌表面，或釋放至細(xì)菌外環(huán)境中，或直接注入宿主細(xì)胞內(nèi)，與細(xì)菌的生存及致病性密切相關(guān)。Ⅵ型分泌系統(tǒng)（TypeⅥ secretion sy

2、stem，T6SS）的裝置和噬菌體的結(jié)構(gòu)很相似，存在于超過(guò)1/4的細(xì)菌中。研究表明，T6SS在不同細(xì)菌中發(fā)揮不同作用，包括促進(jìn)細(xì)菌毒力、抑制細(xì)菌的復(fù)制及調(diào)節(jié)菌間關(guān)系等。在很多致病性大腸桿菌中存在完整的T6SS編碼基因簇，目前在APEC中發(fā)現(xiàn)3個(gè)T6SS基因簇，分別為T(mén)6SS1、T6SS2、T6SS3。然而，APEC中T6SS核心組分的功能研究甚少，具體作用尚不清楚。研究表明，外界環(huán)境的特定信號(hào)能夠調(diào)控T6SS的表達(dá)，例如攝鐵調(diào)節(jié)蛋白是細(xì)

3、菌鐵依賴基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其可以直接調(diào)控某些條件性病原菌T6SS的表達(dá)，如EAEC和愛(ài)德華菌。另外，雙組分系統(tǒng)也可調(diào)控T6SS的表達(dá)及功能，如沙門(mén)菌與銅綠假單胞菌SsrB雙組分系統(tǒng)負(fù)調(diào)控T6SS，因此在細(xì)菌感染后期才能檢測(cè)到T6SS的分泌蛋白。T6SS作為新近發(fā)現(xiàn)的蛋白分泌系統(tǒng)，VgrG作為T(mén)6SS核心組分，即是結(jié)構(gòu)蛋白又是分泌蛋白，對(duì)T6SS的結(jié)構(gòu)及功能至關(guān)重要。本研究克隆表達(dá)T6SS核心組分VgrG、分析vgrG基因缺失株的生

4、物學(xué)特性、雙組分系統(tǒng)cpxR基因缺失株的生物學(xué)特性及對(duì)T6SS表達(dá)水平的影響，為進(jìn)一步研究APEC致病作用奠定基礎(chǔ)。
　　1.禽致病性大腸桿菌T6SS2核心組分VgrG克隆表達(dá)
　　根據(jù)APEC DE719 T6SS2毒力島vgrG基因序列，設(shè)計(jì)合成克隆表達(dá)引物，以APEC DE719菌株基因組為模板，擴(kuò)增vgrG基因。通過(guò)雙酶切定向克隆于原核表達(dá)載體pET30a中，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET30a-vgrG。然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

5、表達(dá)宿主菌BL21(DE3)中，構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)菌株BL21-pET30a-vgrG。經(jīng)過(guò)1.0mM IPTG誘導(dǎo)后可表達(dá)分子量為73kDa的融合蛋白，進(jìn)一步通過(guò)SDS-PAGE分析表明融合蛋白位于包涵體中。純化蛋白后免疫新西蘭大白兔，獲得免疫血清，經(jīng)過(guò)ELISA鑒定具有良好的特異性。
　　2.禽致病性大腸桿菌T6SS2vgrG基因突變株、互補(bǔ)株構(gòu)建及其特性分析
　　為研究T6SS2核心組分VgrG在APEC致病過(guò)程中的作用，

6、本研究利用Red同源重組系統(tǒng)構(gòu)建DE719的vgrG基因缺失株，并通過(guò)低拷貝質(zhì)粒pSTV28構(gòu)建vgrG缺失互補(bǔ)株。通過(guò)一系列生物學(xué)特性試驗(yàn)比較分析野生株、缺失株與互補(bǔ)株的生長(zhǎng)特性、運(yùn)動(dòng)性、生物被膜形成能力、黏附侵襲能力、動(dòng)物致病力等差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)vgrG基因缺失株和互補(bǔ)株有較好的遺傳穩(wěn)定性，且二者的生長(zhǎng)速度和運(yùn)動(dòng)能力與野生株相比沒(méi)有明顯差異，提示vgrG基因與APEC的生長(zhǎng)繁殖和運(yùn)動(dòng)性無(wú)關(guān)。另外，T6SS2核心組分VgrG不影響DE7

7、19生物被膜的形成。細(xì)胞黏附試驗(yàn)結(jié)果顯示，vgrG基因缺失株對(duì)DF-1細(xì)胞的黏附能力增強(qiáng)。致病性試驗(yàn)表明缺失VgrG導(dǎo)致APEC的體內(nèi)定殖能力及致病力顯著下降，在APEC感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用，為了解APEC的致病作用提供參考。
　　3.禽致病性大腸桿菌cpxR基因缺失株、互補(bǔ)株構(gòu)建及其特性分析
　　本研究利用Red同源重組系統(tǒng)構(gòu)建DE719的cpxR基因缺失株，并通過(guò)低拷貝質(zhì)粒pSTV28構(gòu)建cpxR缺失互補(bǔ)株。通過(guò)一系列

8、試驗(yàn)分析比較野生株、cpxR基因缺失株及cpxR基因互補(bǔ)株的生物學(xué)特性、致病力、T6SS2基因表達(dá)水平，探討cpxR基因?qū)PEC致病性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)cpxR基因缺失株和互補(bǔ)株有較好的遺傳穩(wěn)定性，且其生長(zhǎng)速度、運(yùn)動(dòng)能力和生物被膜形成能力與野生株相比沒(méi)有明顯差異，提示cpxR與APEC的生長(zhǎng)繁殖、運(yùn)動(dòng)性和生物被膜形成能力無(wú)關(guān)。血清殺菌試驗(yàn)結(jié)果表明，cpxR基因缺失株的抗血清殺菌能力明顯低于野生株。感染試驗(yàn)結(jié)果顯示，cpxR缺失導(dǎo)致APE