B7-H1在間充質(zhì)干細(xì)胞保護(hù)腸缺血再灌注損傷中的作用.pdf

1、目的:1.探討小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stem cells ADSCs)的體外分離、培養(yǎng)、純化方法及其表型的鑒定，從而為間充質(zhì)干細(xì)胞的來(lái)源提供更加廣闊的選擇。2.小鼠腸缺血再灌注損傷動(dòng)物模型的建立和評(píng)估。3.探討B(tài)7-H1/PD-1信號(hào)通路在脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞保護(hù)腸缺血再灌注損傷中發(fā)揮的作用。
　　方法:1.取5～6周齡，體重約20 g的健康、雄性C57BL/6小鼠，采用貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)、純化其AD

2、SCs，觀察原代及傳代細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及生長(zhǎng)狀況，并用流式細(xì)胞儀鑒定其第3代細(xì)胞的表型。2.建立C57 BL/6小鼠腸缺血再灌注損傷模型:取6周齡，體重約20g的健康、雄性C57 BL/6小鼠，術(shù)前可自由飲水，禁食12小時(shí)，手術(shù)在嚴(yán)格無(wú)菌條件下進(jìn)行，使用無(wú)損動(dòng)脈夾夾閉小鼠腸系膜前動(dòng)脈的起始部，30min后松開(kāi)血管夾，逐層關(guān)腹，以建立腸缺血再灌注損傷模型，建模成功后24小時(shí)處死小鼠觀察小腸組織的損傷情況。3.取第三代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞制成單細(xì)

3、胞懸液，濃度為1×106/ml，將動(dòng)物分為三組:B7H1+組、B7H1組、對(duì)照組，三組依次建立腸缺血再灌注損傷動(dòng)物模型，B7-H1+組經(jīng)靜脈注入體積為1ml的單細(xì)胞懸液，B7-H1-組經(jīng)靜脈注入等體積的細(xì)胞懸液（抗B7-H1單克隆抗體處理），對(duì)照組僅注入等體積的生理鹽水，分別于術(shù)后6小時(shí)、24小時(shí)、72小時(shí)處死小鼠，獲取小腸組織和動(dòng)物血清留以備用，用4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(DAPI)標(biāo)記脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，觀察ADSCs在小腸的定植情

4、況，小腸組織行常規(guī)HE染色觀察腸道黏膜，酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)方法測(cè)定不同處理組別之間細(xì)胞因子的水平，以探討共刺激分子B7-H1在腸缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用。
　　結(jié)果:1.成功分離、培養(yǎng)、純化ADSCs，倒置相差顯微鏡觀察原代接種24小時(shí)后可見(jiàn)較多細(xì)胞貼壁，72小時(shí)后細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，細(xì)胞形態(tài)多呈梭形生長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)換液和多次傳代后，雜質(zhì)細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，ADS

5、Cs逐漸純化;細(xì)胞表面標(biāo)記物經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果為CD90、CD29均為高表達(dá);CD34、CD45為低表達(dá)。
　　2.實(shí)驗(yàn)組小鼠夾閉腸系膜前動(dòng)脈后發(fā)現(xiàn)腸系膜前動(dòng)脈搏動(dòng)消失，腸管逐漸變白、痙攣甚至皺縮。恢復(fù)血管血供以后，動(dòng)脈逐漸恢復(fù)搏動(dòng)，腸管逐漸恢復(fù)蠕動(dòng)，顏色由灰白色變?yōu)轷r紅色。小腸組織常規(guī)病理鏡下觀察多數(shù)標(biāo)本小腸黏膜破損嚴(yán)重、潰瘍和出血，固有層破壞嚴(yán)重，同時(shí)可見(jiàn)中性粒細(xì)胞大量浸潤(rùn)伴有黏膜的局部出血，甚至存在固有層腺體的破壞，腸絨毛

6、嚴(yán)重萎縮。
　　3.DAPI標(biāo)記的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可以定向遷移到受損的腸道，B7-H1+治療組大鼠的血清IL-2、TNF-α水平在治療后6h和24h顯著低于對(duì)照組和B7H1-組(P＜0.05);血清IL-10的水平則顯著高于對(duì)照組和B7H1-組(P＜0.05)，腸組織病理顯示B7H1+治療組的腸道修復(fù)更快。
　　結(jié)論:1.貼壁培養(yǎng)法可以成功分離、培養(yǎng)及純化ADSCs，且其細(xì)胞純度比較高，同時(shí)由于脂肪組織來(lái)源充分、易于獲取等優(yōu)