hBMP-7基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植保護(hù)腎缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：腎臟的缺血再灌注損傷(IRI)導(dǎo)致急性腎功能衰竭(ARF)的發(fā)生率很高，治療措施也有限，死亡率大約為30％～50％，因此防治腎臟IRI具有重要的意義，各國研究者都在尋求解決辦法。針對(duì)IRI的研究很多，其中關(guān)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)對(duì)IRI腎臟的保護(hù)作用的研究是近年研究的熱點(diǎn)。BM-MSCs移植可促進(jìn)腎臟IRI的修復(fù)并改善腎功能，但是，移植的BM-MSCs數(shù)量有限，而且能到達(dá)損傷腎臟并發(fā)揮作用的.BM-MSCs更少，因此

2、，BM-MSCs的治療作用受限。為了提高BM-MSCs的治療作用，很多科學(xué)家采用基因治療和細(xì)胞移植相結(jié)合的方法來進(jìn)行研究，取得了一定的效果。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(BMP-7)具有調(diào)控細(xì)胞增殖作用，對(duì)腎臟的發(fā)育和功能維持起著重要作用。研究表明，缺血再灌注后，腎臟BMP-7蛋白的表達(dá)明顯減少，可能參與腎臟IRI的發(fā)病過程；應(yīng)用外源性BMP-7基因治療和蛋白治療能促進(jìn)腎功能的恢復(fù)，但缺乏靶向性，治療效果有限。因此，本課題首次通過腺病毒載體將人B

3、MP-7(hBMP-7)基因?qū)?BM-MSCs，然后將基因修飾的BM-MSCs移植入動(dòng)物體內(nèi)，觀測其對(duì)。腎臟IRI的保護(hù)效用，并探討其作用機(jī)制。據(jù)所查文獻(xiàn)，目前尚未見國內(nèi)外研究報(bào)道。 目的：基于單純BM-MSCs移植治療或：BMP-7基因治療的不足，本課題擬采用BMP-7基因治療和BM-MSCs移植治療結(jié)合的方法，通過腺病毒介導(dǎo)hBMP-7基因轉(zhuǎn)染BM-MSCs，觀察基因修飾的BM-MSCs移植能否發(fā)揮更好的保護(hù)腎臟IRI的作

4、用。 方法： 第一部分：Ad-hBMP-7的構(gòu)建與鑒定 酶切含hBMP-7基因的pBluescriptsk(+)-hBMP-7質(zhì)粒，構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pDC316-hBMP-7，擴(kuò)增、提純后與骨架質(zhì)粒pBHGloxAEl，3Cre、脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，通過同源重組獲得重組體Ad-hBMP-7，擴(kuò)增、純化后獲得Ad-hBMP-7病毒液；對(duì)構(gòu)建的質(zhì)粒和腺病毒進(jìn)行酶切、測序、ELISA和免疫組化鑒定。 第二

5、部分：Ad-hBMP-7體外轉(zhuǎn)染兔BM-MSCs以及表達(dá)產(chǎn)物hBMP-7的測定 采用密度梯度離心法和貼壁法相結(jié)合的方法分離培養(yǎng)兔BM-MSCs，將Ad-hBMP-7轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的BM-MSCs，通過形態(tài)學(xué)和MTT法觀察轉(zhuǎn)染后BM-MSCs的生長情況，RTI-PCR、免疫組化、WesternB1ot和ELISA檢測目的基因hBMP-7在體外轉(zhuǎn)染的BM-MSCs中的表達(dá)。 第三部分：hBMP-7基因修飾的BM-MSCs移植對(duì)

6、兔腎臟IRI的保護(hù)作用 1.經(jīng)兔脛骨抽取骨髓，分離培養(yǎng)BM-MSCs，移植前以MOI為100的腺病毒轉(zhuǎn)染，并以Hoechst33342標(biāo)記； 2.建立兔腎臟冷缺血再灌注損傷模型：阻斷血流后利用切除腎的殘端對(duì)對(duì)側(cè)腎進(jìn)行冷鹽水灌注后低溫保存； 3.所有實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為6組：Ⅰ組為假手術(shù)組；Ⅱ組為IRI對(duì)照組；Ⅲ組：缺血再灌注后進(jìn)行Ad-EGFP腺病毒轉(zhuǎn)染的BM-MSCs移植；Ⅳ組：缺血再灌注后體內(nèi)注射Ad-hBMP-7

7、治療；Ⅴ組：缺血再灌注后Ad-EGFP腺病毒轉(zhuǎn)染的BM-MSCs移植聯(lián)合Ad-hBMP-7體內(nèi)注射治療；Ⅵ組：缺血再灌注后進(jìn)行Ad-hBMP-7腺病毒轉(zhuǎn)染的BM-MSCs移植。 4.各組分別在缺血再灌注后第3天、第7天和第14天進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的檢測。RT-PCR、ELISA和WesternBlot法檢測目的基因hBMP-7在兔腎臟的表達(dá)；RT-PCR和ELISA法檢測兔腎臟內(nèi)源性BMP-7和FGF-β1的表達(dá)；比色法測定腎臟SOD

8、活性和MDA含量；熒光顯微鏡下觀察腎臟Hoechst33342陽性細(xì)胞以及Hoechst333412和CK18雙陽性細(xì)胞數(shù)量以了解移植的BM-MSCs在腎臟的分布及其向腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化情況；免疫組化染色檢測腎臟Bax和Bcl-2的含量并計(jì)算兩者比值；進(jìn)行PCNA免疫組化染色了解腎臟細(xì)胞增殖狀態(tài)；TUNEL檢測腎臟細(xì)胞凋亡情況；光鏡和透射電鏡下觀察腎臟組織的組織學(xué)結(jié)構(gòu)變化；測定腎臟功能(肌酐、尿素)。 結(jié)果： 1.酶切

9、與測序證明成功構(gòu)建了穿梭質(zhì)粒pDC316-hBMP-7，將其與骨架質(zhì)粒pBHGloxAE1，3Cre、脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，通過同源重組獲得重組體Ad-hBMP-7，擴(kuò)增、純化后獲得Ad-hBMP-7病毒液，經(jīng)PCR、ELISA和免疫組化鑒定，結(jié)果表明Ad-hBMP-7的構(gòu)建正確；經(jīng)FCID50法測定制備的Ad-hBMP-7病毒液滴度為7.94.×1010IU/ml，可進(jìn)行體內(nèi)外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。 2.采用密度梯度離心法和貼壁法

10、相結(jié)合的方法成功分離培養(yǎng)BM-MSCs，確定Ad-hBMP-7體外轉(zhuǎn)染BM-MSCs的最佳.MOI值為100，轉(zhuǎn)染效率達(dá)90.52％。Ad-hBMP-7轉(zhuǎn)染的：BM-MSCs與未轉(zhuǎn)染的BM-MSCs相比，細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變，生長未見明顯促進(jìn)或抑制，說明構(gòu)建的腺病毒轉(zhuǎn)染是安全的。Ad-hBMP-7轉(zhuǎn)染BM-MSCs后，ELISA法檢測顯示其上清液中有hBMP-7蛋白的分泌，細(xì)胞免疫組化和WesternBlot檢測顯示細(xì)胞內(nèi)有hBMP-7

11、蛋白的表達(dá)，RT-PCR檢測顯示細(xì)胞內(nèi)有hBMP-7mRNA的表達(dá)；未轉(zhuǎn)染組均為陰性。RT-PCR法、WesternB1ot法和ELISA法檢測到hBMP-7的表達(dá)，在第3天達(dá)到高峰，并在此較高水平維持到第7天左右，然后開始緩慢下降，持續(xù)時(shí)間超過2周，滿足體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的要求。 3.①：Hoechst33342標(biāo)記BM-MSCs的方法可靠；成功建立腎臟冷缺血再灌注損傷模型，手術(shù)兔存活良好。②Ⅵ組通過RT-PCR、ELIsA和weste

12、rn檢測到hBMP-7mRNA和蛋白在腎臟的表達(dá)，并明顯高于Ⅳ組和Ⅴ組(P＜0.05)。③熒光顯微鏡下心臟、肝臟、脾臟和肺臟均未見Hoechst33342陽性細(xì)胞；腎臟組織可見Hoechst33342陽性細(xì)胞，主要分布在腎臟的腎皮-髓質(zhì)交界區(qū)的腎臟皮質(zhì)內(nèi)區(qū)和腎臟髓質(zhì)外區(qū)的腎小管組織；Ⅵ組腎臟組織內(nèi)Hoechst33342陽性細(xì)胞數(shù)在移植后各時(shí)間點(diǎn)均高于Ⅲ組和Ⅴ組(P＜0.05)。Hoechst33342和CK18雙陽性細(xì)胞代表移植的外源

13、性：BM-MSCs分化的腎小管上皮細(xì)胞，Ⅵ組腎臟組織內(nèi)Hoechst33342和CK18雙陽性細(xì)胞數(shù)在移植后各時(shí)間點(diǎn)均高于Ⅴ組，差異有顯著性(P＜0.05)。④與Ⅰ組比較，Ⅱ組腎臟BMP-7mRNA和蛋白明顯降低，TGF-β1mRNA和蛋白明顯升高(P＜0.05)；Ⅵ組腎臟BMP-7mRNA和蛋白高于其它缺血再灌注組，TGF-β1mRNA和蛋白低于其它缺血再灌注組(P＜0.05)。與其它缺血再灌注組比較，Ⅵ組腎小管上皮細(xì)胞增殖指數(shù)(PI

14、)、Bcl-2含量、Bcl-2/Bax比值最高，腎小管上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)、Bax含量最低(P＜0.05)。⑤缺血再灌注各組比較，Ⅵ組SOD活性最高，MDA含量最低(P＜0.05)。⑥缺血再灌注各組比較，Ⅵ組腎臟組織學(xué)改變最輕，肌酐和尿素最低(P＜0.05)。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建含hBMP-7基因的重組腺病毒Ad-hBMP-7，能體外高效轉(zhuǎn)染BM-MSCs而且不影響其生長增殖，可獲得目的蛋白hBMP-7的有效表達(dá)；

15、 2.成功建立腎臟冷缺血再灌注損傷模型，更符合臨床移植腎的損傷實(shí)際情況，并簡化了操作，減輕了對(duì)血管的損傷。 3.Ad-hBMP-7基因修飾的BM-MSCs能優(yōu)先向損傷腎臟遷移，明顯提高腎臟局部hBMP-7的表達(dá)，從而彌補(bǔ)腎臟內(nèi)源性BMP-7表達(dá)降低的不足，發(fā)揮靶向性基因治療作用； 4.與單純BM-MSCs移植或Ad-hBMP-7基因治療或BM-MSCs移植和Ad-hBMP-7基因聯(lián)合治療相比，Ad-hBMP-7基

16、因修飾的BM-MSCs移植能更明顯地減輕腎臟損傷的程度，促進(jìn)損傷腎臟的修復(fù)，改善腎臟功能。Ad-hBMP-7基因修飾的BM-MSCs移植能更好地保護(hù)腎臟IRI與BM-MSCs和腎臟局部高表達(dá)的hBMlP-7協(xié)同發(fā)揮以下作用有關(guān)：明顯降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度，增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的能力；明顯促進(jìn)內(nèi)源性BMlP-7蛋白表達(dá)的恢復(fù)，降低TGF-β1的表達(dá)；明顯上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，增加Bcl-2/Bax比值，從而促進(jìn)細(xì)胞