Akt基因修飾羊水間充質(zhì)干細胞移植對兔心肌缺血再灌注損傷的作用研究.pdf

1、對急性心肌梗塞的再灌注治療已經(jīng)成為一種重要且不可或缺的方法，然而對隨之而來的再灌注損傷目前無切實、有效的方法，是當(dāng)今心血管醫(yī)學(xué)界迫切需要解決的棘手問題之一。近年來隨著干細胞學(xué)研究及分子生物學(xué)技術(shù)的突破性進展，為缺血再灌注損傷的治療帶來了新的希望。然而選取取材容易的、存活時間長、無致瘤性、分化能力強的干細胞，以及提高干細胞在缺血缺氧環(huán)境中生存率是目前干細胞治療的焦點。羊水間充質(zhì)干細胞具有易取得、無倫理學(xué)問題、存活時間長、分化能力強等特點，

2、是優(yōu)良的干細胞選擇。另外近年來發(fā)現(xiàn)基因修飾對改善干細胞的存活率有一定的效果。課題組前期已經(jīng)成功分離和培養(yǎng)兔羊水間充質(zhì)干細胞，在體外經(jīng)誘導(dǎo)可分化為心肌樣細胞；構(gòu)建兔Akt過表達慢病毒載體并成功轉(zhuǎn)染羊水間充質(zhì)干細胞?，F(xiàn)為明確Akt基因修飾羊水間充質(zhì)干細胞移植對缺血再灌注損傷心肌的作用和可能機制，我們通過體內(nèi)和體外實驗進一步深入研究。
　　第一部分缺氧對Akt基因修飾羊水間充質(zhì)干細胞的作用研究
　　目的:
　　探討在體外缺氧

3、對Akt基因修飾羊水間充質(zhì)干細胞的影響。
　　方法：
　　培養(yǎng)空病毒轉(zhuǎn)染的羊水間充質(zhì)干細胞（null-AFMSCs）和Akt基因慢病毒轉(zhuǎn)染的羊水間充質(zhì)干細胞（Akt-AFMSCs），兩組細胞分為正常組和缺氧組。WST-1法檢測 null-AFMSCs和Akt-AFMSCs分別在正常和缺氧環(huán)境下12小時的存活率；Western Blot檢測顯示各組表達P-Akt水平；運用caspase-3活性檢測試劑盒檢測null-AFMSC

4、s和Akt-AFMSCs在正常和缺氧下促凋亡因子caspase-3活性表達；real-time PCR方法檢查細胞培養(yǎng)液中的細胞因子VEGF、HGF、bFGF和IGF-1等的表達。
　　結(jié)果：
　　WST-1法檢查顯示在缺氧組中Akt-AFMSCs的存活率明顯高于null-AFMSCs（P<0.05）；Western Blot檢測顯示缺氧組中P-Akt表達均升高，且Akt-AFMSCs表達 P-Akt水平明顯高于null-A

5、FMSCs（P<0.05）；Akt-AFMSCs在體外缺氧環(huán)境中caspase-3活性水平低于null-AFMSCs（P<0.05）；real-time PCR檢查顯示缺氧組中Akt-AFMSCs較null-AFMSCs分泌更多的細胞因子VEGF、HGF、bFGF和IGF-1等（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　缺氧可使AFMSCs表達P-Akt升高；Akt基因修飾能使P-Akt表達進一步升高，增強AFMSCs在體外對缺氧的

6、耐受力，促使其分泌更多的細胞因子，從而可能使其發(fā)揮促增殖分化、促微血管生成、抗凋亡等作用增強。
　　第二部分Akt基因修飾羊水間充質(zhì)干細胞移植對兔缺血再灌注損傷心肌的作用研究
　　目的：
　　探討Akt基因修飾羊水間充質(zhì)干細胞移植對兔缺血再灌注損傷心肌的作用和機制。
　　方法：
　　培養(yǎng)空病毒轉(zhuǎn)染的羊水間充質(zhì)干細胞（null-AFMSCs）和Akt基因慢病毒轉(zhuǎn)染的羊水間充質(zhì)干細胞（Akt-AFMSCs）。將

7、新西蘭兔分成4組，分別為假手術(shù)組、對照組（心肌注射DMEM）、null-AFMSCs組(心肌注射null-AFMSCs)和Akt-AFMSCs組（心肌注射 Akt-AFMSCs）。制備兔心肌缺血再灌注模型，在再灌注開通前將5-溴脫氧尿嘧啶（Brdu）標記的null-AFMSCs和Akt-AFMSCs分別移植到null-AFMSCs組和Akt-AFMSCs組的梗死心肌和周邊區(qū)。移植后21天超聲心動圖測定心功能；然后處死取心肌組織。HE染色

8、觀察病理變化，masson染色觀察心肌纖維化，透射電鏡觀察移植后心肌的超微結(jié)構(gòu)，TTC染色比較心肌梗死范圍，免疫熒光檢測心肌組織中移植羊水間充質(zhì)干細胞的分布，TUNEL法檢測心肌細胞凋亡，RT-PCR方法檢測心肌組織GATA-4表達，免疫組化法檢測cTNT、毛細血管表達，western-blot法檢測connexin-43、VEGF、Akt、P-Akt、caspase-3和bcl-2表達等。
　　結(jié)果：
　　羊水間充質(zhì)干細胞

9、細胞移植后21天，心臟超聲心動圖顯示與對照組比較，null-AFMSCs組和Akt-AFMSCs組FS、EF明顯升高（P<0.05）；且Akt-AFMSCs組較null-AFMSCs組FS和EF升高更明顯（P<0.05）。TTC染色顯示Akt-AFMSCs組的心肌梗死面積明顯低于對照組和null-AFMSCs組〔（10.4±2.6)％比(26．3±2．5)％和(17．5±3．3)％，（P<0.05）]。HE染色顯示Akt-AFMSCs組

10、病理損傷變化明顯減輕。透射電鏡觀察Akt-AFMSCs移植后心肌肌絲溶解和斷裂、基質(zhì)空化等變化較 null-AFMSCs組減輕。免疫熒光顯示缺血再灌血注心肌中殘存少量移植的羊水間充質(zhì)干細胞，但 Akt-AFMSCs組殘存的羊水間充質(zhì)干細胞多于null-AFMSCs組（P<0.05）。與對照組和 null-AFMSCs組比較，Akt-AFMSCs組心肌細胞凋亡數(shù)量明顯減少（P<0.05）。免疫組化顯示Akt-AFMSCs組缺血再灌注損傷心

11、肌中微血管數(shù)量和心肌細胞特異性cTNT表達明顯多于對照組和null-AFMSCs組（P<0.05）。western-blot檢測顯示Akt-AFMSCs組缺血再灌注心肌組織中p-Akt、bcl-2、VEGF、connexin-43表達較對照組和null-AFMSCs組升高，caspase-3蛋白表達減低（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　羊水間充質(zhì)干細胞移植入兔缺血再灌注損傷心肌中，具有修復(fù)損傷心肌、減少梗死面積、改善心臟功