大鼠肺缺血再灌注損傷基因表達(dá)譜的變化和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的干預(yù)作用.pdf

1、第一部分大鼠肺缺血再灌注損傷不同時(shí)期基因表達(dá)譜的變化
　　 目的：探討缺血再灌注誘導(dǎo)大鼠肺組織損傷不同時(shí)期基因表達(dá)譜的變化，闡明肺缺血再灌注的動(dòng)態(tài)損傷機(jī)制，通過(guò)篩選損傷和修復(fù)的相關(guān)基因，為肺缺血再灌注損傷的干預(yù)治療提供新的線索和思路。
　　 方法：雄性SD大鼠36只，實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為對(duì)照組(假手術(shù)組,6只)和缺血再灌注組(I/R 0、1、3、6、24小時(shí)組，各組6只)。通過(guò)阻斷肺門(mén)建立大鼠肺缺血再灌注損傷模型，于再灌注后不同

2、時(shí)間點(diǎn)取大鼠肺組織并提取標(biāo)本總RNA, 運(yùn)用包含22 226個(gè)大鼠基因點(diǎn)的Illumina RatRef-12 全基因組表達(dá)譜微珠芯片檢測(cè)對(duì)照組和模型組肺缺血再灌處理后不同時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)情況，并采用SOM算法將具有相似表達(dá)模式的基因進(jìn)行聚類(lèi)分析。
　　 結(jié)果：缺血后再灌0，l，3，6，24 h分別有648，340，711，1279，641個(gè)基因表達(dá)發(fā)生改變。根據(jù)基因的功能不同將部分發(fā)生顯著改變的基因分為七類(lèi)，包括炎性相關(guān)因子、

3、凋亡調(diào)控相關(guān)蛋白、氧化與抗氧化分子、代謝相關(guān)酶類(lèi)、離子通道及水通道、信號(hào)傳導(dǎo)分子以及補(bǔ)體系統(tǒng)等七類(lèi)。同時(shí)通過(guò)聚類(lèi)分析將具有相同表達(dá)模式的基因被聚為l2類(lèi)。
　　 結(jié)論：缺血再灌注可以誘導(dǎo)肺的基因表達(dá)譜發(fā)生改變，基因表達(dá)譜芯片能夠快速、高效地篩選差異表達(dá)基因，多種不同功能的基因相互影響共同造成肺缺血后再灌損傷，具有相似表達(dá)模式的基因可能具有相似的功能或相似的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。
　　 第二部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性和誘

4、導(dǎo)分化
　　 目的：建立大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MesenchymAlStem Cells, MSCs)的分離和培養(yǎng)方法，探討MSCs的生物學(xué)特性和不同情況下的多向分化潛能，為將MSCs作為基因載體應(yīng)用于體內(nèi)細(xì)胞治療和構(gòu)建新型氣管組織工程軟骨種子細(xì)胞提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法：采用原代貼壁法獲得間充質(zhì)干細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)變化，篩選細(xì)胞培養(yǎng)的最佳條件。流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志，體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞

5、和軟骨細(xì)胞分化。采用EGFP慢病毒載體感染培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞，比較細(xì)胞感染前后生物學(xué)特性。觀察綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP）基因通過(guò)慢病毒載體感染MSCs的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：原代貼壁法獲可獲得純度較高的MSCs，穩(wěn)定培養(yǎng)液的pH值能使MSCs穩(wěn)定傳代。流式細(xì)胞儀檢測(cè)示大鼠MSCs的表型為CD11b-CD34-CD44+CD45-CD90+CD-106+。體外MSCs能誘導(dǎo)分化為

6、脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。慢病毒載體可有效感染大鼠MSCs，EGFP在MSCs中能長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，聚凝胺可增強(qiáng)感染效率。
　　 結(jié)論：穩(wěn)定pH值的培養(yǎng)液能使大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞保持旺盛的生長(zhǎng)能力，間充質(zhì)干細(xì)胞具有良好的多向分化能力。慢病毒能高效感染間充質(zhì)干細(xì)胞， GFP基因能在間充質(zhì)干細(xì)胞中長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)。本研究建立了一種有效、穩(wěn)定、持久的大鼠骨髓MSCs分離培養(yǎng)及熒光基因標(biāo)記技術(shù)，為研究MSCs的轉(zhuǎn)歸、可塑性及基因治療奠定了基礎(chǔ)。

7、
　　 第三部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)肺缺血再灌注損傷的干預(yù)作用
　　 目的：探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）植入大鼠肺缺血再灌注損傷（I/R）模型中的效應(yīng)、分化及其相關(guān)的作用機(jī)制。
　　 方法：分離純化培養(yǎng)MSCs，進(jìn)行GFP標(biāo)記，將MSCs注射大鼠肺I/R損傷模型及對(duì)照組，觀察再灌注后6h、1d、3d、7d等時(shí)間點(diǎn)肺的病理變化及功能改變，以及不同時(shí)間點(diǎn)MSCs向肺內(nèi)遷移和在肺內(nèi)的存留情況，通過(guò)免疫組化方法觀察

8、在肺內(nèi)MSCs的分化。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肺組織TNF-αmRNA和C5 mRNA表達(dá)變化，ELISA檢測(cè)IL-1β、IL-10、IL-17、KGF、MIP-1α等炎性因子含量的改變。
　　 結(jié)果：MSCs植入I/R模型可以降低肺濕重比和MPO活力，MSCs可以向肺內(nèi)遷移，以24h 至3d 數(shù)量較多，再灌后7d仍可見(jiàn)存留于肺內(nèi)，數(shù)量減少，但7d時(shí)觀察到帶有EGFP和SP-C雙標(biāo)陽(yáng)性的MSCs。相對(duì)于單純I/R損傷組，MSCs可