亞型CD200陽性的胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細胞促進人肝細胞再生.pdf

1、既往研究認為，人胎盤間充質(zhì)干細胞對治療急性肝衰竭是有益的。在急性肝衰竭中，巨噬細胞和其分泌的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是參與肝細胞凋亡和急性肝衰竭發(fā)展的主要因素之一。CD200陽性人胎盤間充質(zhì)干細胞(CD200positive human placenta mesenchymal stem cells，CD200+hPMSCs)通過與表達在NK細胞、巨噬細胞和DC細胞等上的CD200受體結(jié)合，可抑制這些細胞活性、轉(zhuǎn)變免疫反應(yīng)的類型和

2、抑制巨噬細胞釋放TNF-α。目前，間充質(zhì)干細胞對肝臟再生方面的研究較多，如改善肝臟代謝，抑制肝臟纖維化以及抑制肝細胞凋亡等，部分并已應(yīng)用于臨床疾病的治療。然而，CD200+hPMSCs對人肝臟再生的影響仍然研究較少。
　　目的:探討在共培養(yǎng)系統(tǒng)中，CD200陽性的人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細胞(CD200positive human placenta chorionic mesenchymal stem cells, CD200+hPC

3、MSCs)對人正常肝細胞代謝、增殖和凋亡的影響。
　　方法:利用Ⅱ型膠原酶和胰酶消化法從胎盤絨毛膜中分離胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細胞(hPCMSCs)，免疫磁珠分選法從hPCMSCs中富集CD200+hPCMSCs。采用生理鹽水和Ⅱ型膠原酶兩步灌流法分離人原代肝細胞。在合成代謝與增殖實驗中，實驗分為陰性對照組（0.5％FBS培養(yǎng)基對照，單獨培養(yǎng)干細胞上清液對照），對照組（單獨培養(yǎng)肝細胞對照）和共培養(yǎng)組（CD200+hPCMSCs:人肝細

4、胞=1∶3、1∶1和3∶1，分別三組）。測定不同組中人原代肝細胞分泌白蛋白和尿素的量，分析不同數(shù)量CD200+hPCMSCs對人肝細胞合成代謝的影響;MTT比色法測定不同組中人HL7702肝細胞的增殖水平，評估不同數(shù)量CD200+hPCMSCs對人肝細胞增殖的影響。在凋亡實驗中，設(shè)陰性對照組，凋亡組和抗凋亡組。采用顯微鏡觀察凋亡形態(tài)、Annexin-Ⅴ/PI標記不同組中凋亡的HL7702肝細胞和流式細胞儀檢測HL7702肝細胞的凋亡比率

5、，以評估相同數(shù)量CD200+hPCMSCs對人肝細胞凋亡的影響。Western blot檢測人HL7702肝細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-xL、Bax和Caspase-3在不同組中的表達水平，進一步評估相同數(shù)量的CD200+hPCMSCs對人肝細胞凋亡影響的干預(yù)機理。
　　結(jié)果:在合成代謝實驗中，各共培養(yǎng)組與對照組中尿素分泌量（1.93±0.42 mg/dl）和白蛋白分泌量(85.63±4.02 ng/ml)相比，共培養(yǎng)細胞比例為1∶3

6、組，尿素和白蛋白分泌量變化均無統(tǒng)計學意義（尿素量為2.53±0.26 mg/dl，P=0.418;白蛋白量為69.15±2.38 ng/ml，P=0.926）;比例為1∶1組，尿素和白蛋白分泌量均高于對照組(尿素量2.99±0.74 mg/dl，P=0.063;白蛋白量172.52±45.19 ng/ml，P＜0.05);比例為3∶1組，尿素和白蛋白分泌量也均高于對照組（尿素量3.35±0.24mg/dl，P＜0.05;白蛋白量249.

7、25±49.83 ng/ml，P＜0.01）。在增殖實驗中，共培養(yǎng)24小時后，1∶1組中HL7702肝細胞增殖水平(114.10±2.75％，P＜0.01)和3∶1組HL7702肝細胞增殖水平(127.16±5.15％，P＜0.01)均高于對照組(100％±0.00％);而與對照組相比，在1∶3組中HL7702肝細胞增殖沒有統(tǒng)計學差異(97.20±1.85％，P=0.391)。在培養(yǎng)48小時，1∶3組(133.36±0.70％，P＜0.

8、05)，1∶1組(133.86±3.30％，P＜0.05)和3∶1組(142.50±12.30％，P＜0.05)HL7702肝細胞的增殖水平均較對照組(130.03±0.55％)高。同時，在培養(yǎng)72小時，1∶3組(161.73±1.96％,P＜0.01),1∶1組(164.90±0.75％,P＜0.01)和3∶1組(171.30±5.40％,P＜0.01)肝細胞的增殖水平也均高于對照組(139.40±1.85％)。此外，在凋亡實驗中，誘

9、導(dǎo)HL7702肝細胞凋亡24 h，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn):抗凋亡組HL7702肝細胞凋亡數(shù)少于凋亡組，且抗凋亡組中肝細胞膜皺縮，細胞核碎裂程度明顯少于凋亡組。在誘導(dǎo)凋亡12h時，流式細胞儀分析提示:抗凋亡組HL7702肝細胞凋亡陽性率(14.30±0.1414％)低于凋亡組HL7702肝細胞凋亡陽性率(20.40±1.4142％)，P＜0.01。Western blot結(jié)果表明:在培養(yǎng)12h和24 h，抗凋亡組抗凋亡Bcl-xL蛋白相對表達量(