CD200基因轉(zhuǎn)染的人胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)異基因小鼠皮膚移植免疫排斥調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、目的：研究CD200基因轉(zhuǎn)染的人胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞(HPMSCs)對(duì)異基因小鼠皮膚移植免疫排斥調(diào)節(jié)的作用,為進(jìn)一步闡明CD200基因的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制提供新線索。為了在動(dòng)物模型中進(jìn)行這一研究,在本課題中我們將用表達(dá)小鼠CD200基因的人胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞代替人CD200陽(yáng)性間充質(zhì)干細(xì)胞亞群,并將研究結(jié)果作為后續(xù)的直接用人CD200陽(yáng)性人胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞亞群作人體條件的研究提供依據(jù)。
　　方法：構(gòu)建表達(dá)小鼠CD200基因的重組腺病毒載體,并

2、用此載體轉(zhuǎn)染人胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞,建立表達(dá)小鼠CD200基因的人胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞。待表達(dá)小鼠CD200基因的胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞長(zhǎng)至60~70％密度的時(shí)候,用Triple消化成單細(xì)胞懸液。選擇40只C57BL/6小鼠作為受體,以Vr:CD1(ICR)乳鼠皮膚作為供體,建立小鼠異基因皮膚移植排斥模型。C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組:①A組(空白對(duì)照組1):C57BL/6小鼠自體皮膚移植;②B組(對(duì)照組2):同種異基因移植+PBS尾靜脈注射;③C

3、組(對(duì)照組3):同種異基因移植+HPMSCs尾靜脈注射;④D組(實(shí)驗(yàn)組):同種異基因移植+表達(dá)小鼠CD200的HPMSCs尾靜脈注射。檢測(cè)項(xiàng)目包括:移植皮片存活時(shí)間,HE染色觀察移植皮片病理改變,術(shù)后7d受體小鼠血液白細(xì)胞數(shù)量,腹腔液巨噬細(xì)胞活化率,ELISA、RT-PCR方法檢測(cè)受體小鼠血液、脾臟中IL-4、IL-17及IFN-γ表達(dá)量的變化。
　　結(jié)果：(1)經(jīng)PCR、酶切、測(cè)序及GFP表達(dá)證實(shí)攜帶CD200基因的重組腺病毒載

4、體rAd-4-mCD200構(gòu)建成功。(2)GFP、Real-TimePCR檢測(cè)rAd-4-mCD200轉(zhuǎn)染的人胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞可以成功表達(dá)mCD200基因。(3)皮膚移植術(shù)后7d,移植皮片存活情況觀察C組較B組移植皮片存活時(shí)間延長(zhǎng)(p<0.001);D組較B組和C組移植皮片存活時(shí)間延長(zhǎng)(p<0.001,p<0.001)。HE染色結(jié)果顯示,D組較B組小鼠皮膚炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。移植后7d受體小鼠血液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)D組較A組和B組白細(xì)胞數(shù)量明

5、顯減少(p<0.05,p<0.05)。C組和D活化型巨噬細(xì)胞的數(shù)量明顯多于A組和B組(p<0.05,p<0.05,p<0.05,p<0.05)。ELISA檢測(cè)結(jié)果表明:C組和D組較A組IL-4含量明顯減少(p<0.05,p<0.05);C組和B組比較,IL-17和IFN-γ含量明顯降低(p<0.01,p<0.01);D組較B組,IL-17和IFN-γ含量明顯降低(p<0.001,p<0.001);D組和A組比較,IL-17含量明顯降低(

6、p<0.01)。RT-PCR測(cè)定結(jié)果表明,C組IL-4、IL-17和IFN-γ的分泌量明顯低于B組(p<0.05,p<0.01,p<0.01);D組較B組,IL-4、IL-17和IFN-γ的分泌量明顯降低(p<0.01,p<0.01,p<0.01);C組和D組的IFN-γ的分泌量也明顯低于A組(p<0.01,p<0.05)。
　　結(jié)論：成功制備表達(dá)小鼠CD200基因的重組腺病毒rAd-4-mCD200。此病毒能在人胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞