結(jié)膜下注射間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠角膜移植排斥作用的研究.pdf

1、目的:
　　角膜移植是許多不可逆角膜損傷及某些先天性角膜病變患者脫盲的唯一治療途徑，角膜移植排斥反應(yīng)是影響角膜植片存活及高危角膜移植失敗的最主要原因。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞（包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞）增殖和功能的作用。在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)，鼠尾靜脈注射MSCs可以抑制角膜移植排斥反應(yīng)的發(fā)生，延長角膜植片的存活時間。在此基礎(chǔ)上，本研究仍采用

2、大鼠同種異體大鼠角膜移植排斥動物模型，通過不同時間點(diǎn)結(jié)膜下注射MSCs，觀察MSCs對角膜移植排斥反應(yīng)的影響，并初步研究MSCs抑制角膜移植排斥反應(yīng)的可能調(diào)控機(jī)制，為MSCs治療角膜移植排斥反應(yīng)探索新的方法和途徑。
　　方法:
　　1.原代培養(yǎng)Wistar大鼠MSCs，達(dá)90％融合時傳代培養(yǎng)。用流式細(xì)胞儀檢測培養(yǎng)細(xì)胞的表型，并做體外誘導(dǎo)分化實驗。第3代細(xì)胞以備后續(xù)實驗使用。
　　2.制作大鼠角膜移植動物模型，隨機(jī)分為4

3、組。
　　A組:對照組，給予等量不含藥物的PBS。
　　B組:術(shù)前結(jié)膜下注射MSCs治療組。
　　C組:術(shù)后一次結(jié)膜下注射MSCs治療組。
　　D組:術(shù)后兩次結(jié)膜下注射MSCs治療組。
　　裂隙燈下對角膜植片進(jìn)行臨床觀察，以混濁、水腫和新生血管3項指標(biāo)作為臨床評估標(biāo)準(zhǔn)，比較各組角膜植片的平均存活時間。
　　3.角膜移植模型建立后10天，收集A、D組大鼠右側(cè)眼球（術(shù)眼），進(jìn)行角膜組織病理HE染色和免疫組

4、織化學(xué)CD4+T細(xì)胞染色。
　　4.角膜移植模型建立后第7天、10天，分別收集A、D組大鼠角膜組織提取總RNA，實時PCR檢測細(xì)胞因子IFN-γ、 IL-2、IL-4、IL-10的表達(dá)情況。
　　5.角膜移植模型建立后第10天，分別收集A、D組角膜組織，角膜組織提取總蛋白，采用ELISA試劑盒檢測角膜組織中細(xì)胞因子IL-4、IL-10的分泌情況。
　　結(jié)果:
　　1.成功分離、培養(yǎng)并鑒定了MSCs，MSCs呈間質(zhì)

5、細(xì)胞特性:梭形，漩渦狀排列。茜素紅染色、油紅染色貼壁細(xì)胞分別呈骨樣細(xì)胞及脂肪樣細(xì)胞分化。
　　2.成功建立大鼠角膜移植動物模型。
　　3.結(jié)膜下注射MSCs治療角膜移植術(shù)后大鼠，術(shù)前MSCs注射組（B組）（8.0±0.9）天較對照組（A組）（9.8±1.2）天縮短了植片存活時間(p＜0.05);術(shù)后一次注射MSCs治療組（C組）(10.8±1.3)天與A組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05);術(shù)后兩次注射MSCs治療組（D組

6、）角膜植片的存活時間（12.6±1.4）天與A組相比顯著延長(p＜0.05)。
　　4.角膜移植術(shù)后10天，角膜組織HE染色結(jié)果顯示，A組角膜植片水腫、增厚，可見大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤，大量新生血管、淋巴管存在。免疫組化可見大量CD4+T細(xì)胞在角膜植床和植片基質(zhì)內(nèi)。D組角膜植片輕度水腫，基質(zhì)輕度增厚，少量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，部分新生血管、淋巴管長入。CD4+T細(xì)胞散在分布，浸潤程度較A組減輕。
　　5.

7、Real-time PCR結(jié)果顯示，角膜移植術(shù)后7天，D組大鼠角膜植片中IFN-γ的mRNA表達(dá)水平較A組降低(p＜0.05)，Th2細(xì)胞因子IL-4和IL-10的mRNA水平升高(p＜0.05);術(shù)后10天，D組大鼠角膜植片中IL-4、IL-10的mRNA水平仍顯著升高(p＜0.05)，但Th1細(xì)胞因子IFN-γ、 IL-2的表達(dá)有下調(diào)趨勢(p＞0.05)。
　　6.角膜組織ELISA結(jié)果顯示，角膜移植術(shù)后10天，D組角膜植片中