小鼠MYSM1基因穩(wěn)定敲除的間充質(zhì)干細(xì)胞系的建立及其免疫調(diào)節(jié)作用.pdf

1、惡性腫瘤一直尚未攻克，血液系統(tǒng)惡性疾病也是如此。但是現(xiàn)在造血干細(xì)胞移植（HSCT）為我們治療惡性血液病帶來了希望，經(jīng)過數(shù)年的發(fā)展，HSCT在臨床的應(yīng)用愈來愈廣泛，移植技術(shù)也日漸成熟，因為移植技術(shù)的進(jìn)步，越來越多的患者能夠獲得生存的機(jī)會，但是HSCT后也具有不少的并發(fā)癥，而移植物抗宿主?。℅VHD）就是其中之一，在臨床上，移植術(shù)后的病人或多或少都會出現(xiàn)GVHD，輕者影響病人的生活質(zhì)量，重者引起移植失敗甚至死亡。所以很多研究致力于尋找更好的

2、解決這個問題的方法。
　　文獻(xiàn)中報道的急性 GVHD(acute-GVHD， aGVHD）和慢性 GVHD（chronic-GVHD,cGVHD）的發(fā)病機(jī)制都表明其是一個免疫相關(guān)的疾病。因此臨床上治療GVHD主要是激素及其他免疫抑制劑。但是，這些藥物對很多病人無效，而且有較多的副作用如感染等，MSCs治療 aGVHD是目前臨床中相對具有前景的一種細(xì)胞療法，并且其副作用很少，因此探究MSCs的免疫調(diào)節(jié)能力具有較重要的臨床意義。

3、>　　間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）具有多向分化能力，因此較多的應(yīng)用于組織損傷的修復(fù)，但它具有的免疫抑制也一直受到廣大研究者的青睞，因此有些學(xué)者證明了其在臨床應(yīng)用于免疫相關(guān)疾病的價值。但是目前對于MSCs具體的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚，其在臨床治療的不穩(wěn)定性也使得它的應(yīng)用受到了限制。為了更好的探究其免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制，為以后的臨床研究提供扎實的理論基礎(chǔ)，我們是否可以從表觀遺傳學(xué)去探討MSCs的調(diào)節(jié)機(jī)制呢？
　　基因表達(dá)的過程相當(dāng)復(fù)雜，而且受多種因素

4、的調(diào)控，因此其調(diào)控的過程也相對復(fù)雜。核小體主要由兩部分組成，一個組蛋白八聚體，一段長約147bp的DNA，并且可發(fā)生如甲基化、去泛素化等多種修飾。
　　那么組蛋白修飾影響基因表達(dá)的方式是什么呢？首先，它能改變組蛋白與DNA結(jié)合，使染色質(zhì)狀態(tài)發(fā)生改變，也可作用于啟動子，使其難以與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而影響基因的表達(dá)。
　　組蛋白 H2A是一種重要的組蛋白，它的去泛素化能夠有效地調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。因此本研究旨在在小鼠上探討組蛋白的一種

5、去泛素化酶MYSM1基因?qū)SCs的免疫學(xué)特性的影響，為了達(dá)到這個研究目的，通過采用基因編輯的技術(shù)將小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞系中的MYSM1基因敲除，然后將培養(yǎng)基因修飾后MSCs的上清與小鼠脾臟淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察其對T淋巴細(xì)胞增殖的影響并檢測各種T淋巴細(xì)胞亞群所分泌因子的表達(dá)情況。
　　那么如何敲除小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞系中的 MYSM1基因呢？擬采用CRISPR-Cas9技術(shù)將 MYSM1基因從小鼠 MSCs中敲除。我們首先利用CRISPR

6、/Cas9基因編輯技術(shù)將 MYSM1基因整合到 CRISPR中，然后用相應(yīng)的CRISPR RNAs來指導(dǎo)MYSM1的降解，我們此技術(shù)借鑒于《Science》雜志中基于CRISPR-Cas9技術(shù)在細(xì)胞系中進(jìn)行基因敲除的新方法，并交給公司Cas9慢病毒及帶有能夠特異剪切 MYSM1基因的 sgRNA序列的病毒，然后完成接下來的工作。該技術(shù)優(yōu)點在于其能夠在基因組的特異位點上進(jìn)行敲除，而且敲除效率較高。同時為了篩選病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，我們在病毒中還

7、加入了嘌呤霉素抗性基因。在公司完成病毒的生產(chǎn)后開始接下來的工作。
　　研究主要分為2部分：
　　首先，利用帶有綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的Cas9慢病毒感染小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞系C3H10T1/2，用CRISPR-Cas9技術(shù)來達(dá)到剪切小鼠MYSM1基因的目的，并利用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）觀察細(xì)胞表面的GFP表達(dá)情況來檢測其轉(zhuǎn)染效率。
　　其次，在成功轉(zhuǎn)染后，收集細(xì)胞內(nèi)的RNA及蛋白質(zhì)，通過定量PCR（qPCR）及蛋白印記的

8、方法分別從MYSM1基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個層面來檢測MYSM1基因是否被成功剪切。
　　鑒定證明成功敲除MYSM1基因后，先通過FCM驗證其對MSCs本身表面特異性標(biāo)記表達(dá)的變化，然后通過與收取細(xì)胞上清與小鼠脾臟淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)對其進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)功能的驗證。
　　通過實驗可以得出以下結(jié)果：
　　1.經(jīng)流式檢測細(xì)胞GFP的表達(dá)情況病毒轉(zhuǎn)染的效率高達(dá)99％；通過qPCR及蛋白印記法發(fā)現(xiàn)MYSM1基因已經(jīng)在小鼠MSCs中敲除，獲得