大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對脾單個核細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用及其機制的實驗研究.pdf

1、目的：研究大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymall stem cells，MSCs）對脾單個核細(xì)胞（mononuclearcell，MNC）體外活化及殺傷能力的影響，探討MSCs的免疫調(diào)節(jié)活性及其作用機制，為MSCs應(yīng)用于臨床提供科學(xué)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.利用全骨髓細(xì)胞貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)MSCs，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并對第三代MSCs行瑞氏.吉姆薩染色，在倒置顯微鏡下觀察染色后的細(xì)胞形態(tài)。用流式細(xì)胞術(shù)（

2、flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測第三代MSCs表面標(biāo)志性分子的表達及細(xì)胞周期分布。通過制作生長曲線和誘導(dǎo)MSCs向成脂肪、成骨方向分化，來研究MSCs的增殖特性和多向分化能力。
　　 2.采用四甲基偶氮唑藍（MTT）法研究不同比例MSCs（MSCs：MNC分別為1：20、1：10、1：2.5）對ConA刺激脾MNC增殖反應(yīng)的抑制作用。
　　 3.采用FCM檢測在20μg/ml ConA刺激下，單獨培養(yǎng)或與不同比

3、例的MSCs（MSCs：MNC分別為1：20、1：10、1：2.5）共培養(yǎng)24h后，脾MNC細(xì)胞表面CD25的表達情況。
　　 4.采用MTT 法檢測MSCs培養(yǎng)上清對脾MNC活化增殖能力的影響；用逆轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（revers transcription PCR，RT-PCR）和ELISA技術(shù)分別檢測MSCs表達 TGF-β1 mRNA的情況以及培養(yǎng)不同時間（24、48、72、96h）MSCs上清中TGF-β1的含量。<

4、br>　　 5.采用RT-PCR技術(shù)半定量檢測在20μg/ml ConA刺激下，單獨或與不同比例MSCs（MSCs：MNC分別為1：20、1：10、1：2.5）共培養(yǎng)72h后，脾MNC表達IL-2、IL-10以及IFN-γmRNA的水平。并用ELISA技術(shù)檢測在20μg/ml ConA刺激下，單獨培養(yǎng)和與不同比例MSCs（MSCs：MNC分別為1：20、1：10、1：2.5）共培養(yǎng)72h后，脾MNC培養(yǎng)上清中IL-2和IL-10的含量

5、。
　　 6.采用FCM檢測在20μg/ml ConA刺激下，單獨培養(yǎng)或與不同比例MSCs（MSCs：MNC分別為1：20、1：1 0、1：2.5）共培養(yǎng)72h后的脾MNC細(xì)胞周期分布以及凋亡情況；并用RT-PCR和FCM分別從mRNA和蛋白水平檢測脾MNC表達p27和cyclin E的情況。
　　 7.采用乳酸脫氫酶（LDH）釋放法檢測在10μg/ml ConA刺激下，單獨培養(yǎng)或與MSCs共培養(yǎng)48h后，脾MNC對腫瘤

6、細(xì)胞的殺傷能力。采用FCM分析單獨或與MSCs共培養(yǎng)48h后，脾MNC中CD4+CD25+T細(xì)胞亞群的比例；并用RT-PCR技術(shù)半定量分析其Foxp3 mRNA表達量的差異。采用ELISA技術(shù)檢測在10μg/ml ConA刺激下，單獨培養(yǎng)或與MSCs共培養(yǎng)48h后，MNC在24h內(nèi)分泌TGF-β1和IL-10的水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.原代培養(yǎng)的MSCs是一種形態(tài)類似成纖維樣的梭型細(xì)胞，首次傳代時間為8-11天，傳

7、代后4-5天左右即可再次傳代。FCM結(jié)果顯示，第三代MSCs表達CD105、CD44、CD29，但不表達CD34和CD45。細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示，第三代MSCs絕大多數(shù)處于G0/G1期。體外應(yīng)用相應(yīng)的誘導(dǎo)體系，可使大鼠MSCs向成骨、成脂肪方向分化。
　　 2.MSCs能夠顯著抑制ConA刺激的脾MNC增殖反應(yīng)，與MSCs共培養(yǎng)的脾MNC，其刺激指數(shù)明顯低于單獨培養(yǎng)組（P<0.01），而且這種抑制作用隨MSCs比例的增加而增強。

8、
　　 3.FCM檢測結(jié)果顯示，MSCs能夠顯著抑制活化脾MNC表達CD25，在20μg/ml ConA刺激下，與MSCs共培養(yǎng)24h后的脾MNC表達CD25的水平明顯低于脾MNC單獨培養(yǎng)組（P<0.01），而且這種抑制作用隨MSCs比例的增加而增強。
　　 4.MSCs的培養(yǎng)上清也能夠抑制ConA刺激的脾MNC體外活化（P<0.05），占培養(yǎng)體系總體積35％和70％的MSCs培養(yǎng)上清對脾MNC增殖的抑制率分別為13.3

9、2±2.10％和29.87±5.39％。RT-PCR和ELISA檢測結(jié)果均顯示MSCs表達較高水平的TGF-β1。
　　 5.在20μg/ml ConA刺激下，與MSCs共培養(yǎng)72h后的脾MNC表達IL-2和IFN-γ mRNA的水平明顯低于脾MNC單獨培養(yǎng)的對照組（P<0.05），但表達IL-10 mRNA的水平明顯高于對照組（P<0.05）。ELISA實驗結(jié)果顯示，在20μg/mlConA刺激下，與不同數(shù)量MSCs共培養(yǎng)72

10、h后的脾MNC，其培養(yǎng)體系中IL-2的含量明顯低于脾MNC單獨培養(yǎng)的對照組（P<0.01），而IL-10的含量明顯高于對照組（P<0.01）。
　　 6.在20μg/ml ConA刺激下，MSCs可以使脾MNC被阻滯于G0/G1期，抑制其進入S期。隨著MSCs比例的增加，阻滯于G0/G1期的MNC比例越來越高，而進入S期的MNC明顯減少，與脾MNC單獨培養(yǎng)的對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。RT-PCR結(jié)果顯示，MS

11、Cs可以使脾MNC表達p27 mRNA的水平明顯上調(diào)，表達cyclin E mRNA的水平明顯下降，和對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。FCM檢測p27和cyclin E蛋白表達水平的結(jié)果與RT-PCR結(jié)果相一致。
　　 7.FCM檢測的結(jié)果顯示，在20μg/ml ConA刺激72h后，脾MNC單獨培養(yǎng)組的凋亡率為19.24±1.94％。當(dāng)MSCs與脾MNC以1：20共培養(yǎng)時，凋亡率為17.65±2.58％，與單獨培

12、養(yǎng)組相比，P>0.05沒有明顯差異。當(dāng)MSCs與MNC以1：10和1：2.5共培養(yǎng)時，凋亡率分別為13.79±1.16％、10.34±1.26％均明顯低于單獨培養(yǎng)組（P<0.01）。
　　 8.和單獨培養(yǎng)組相比，與MSCs共培養(yǎng)48h后的脾MNC，殺傷腫瘤細(xì)胞能力明顯下降（P<0.05）；脾MNC中CD4+CD25+T細(xì)胞亞群的比例和Foxp3 mRNA的表達量明顯增高（P<0.01）；脾MNC于24h內(nèi)分泌TGF-β1和IL-

13、10的水平明顯高于單獨培養(yǎng)組（P<0.01）。
　　 結(jié)論：
　　 1.利用全骨髓細(xì)胞貼壁培養(yǎng)法可以從SD大鼠骨髓中擴增出一定數(shù)量、且純度較高的MSCs，其生物學(xué)特性與干細(xì)胞相符。
　　 2.MSCs能夠明顯抑制脾MNC的增殖反應(yīng)，而且這種抑制作用具有明顯的量效依賴關(guān)系。
　　 3.MSCs對脾MNC免疫調(diào)節(jié)作用的機制有多個方面:（1）MSCs分泌的TGF-β1可能在其發(fā)揮免疫抑制功能中起一定作用。（2）

14、MSCs對脾MNC的免疫調(diào)節(jié)作用可能與MSCs抑制MNC表達IL-2和IFN-γ，促進MNC表達免疫抑制性細(xì)胞因子IL-10有關(guān)。（3）MSCs對脾MNC的免疫調(diào)節(jié)作用可能與MSCs能夠上調(diào)MNC表達p27的水平，下調(diào)MNC表達cyclin E的水平，從而使MNC阻滯于G0/G1期有關(guān)。
　　 4.MSCs對脾MNC免疫調(diào)節(jié)作用的機制與誘導(dǎo)MNC凋亡無明顯相關(guān)。
　　 5.與MSCs共培養(yǎng)后的脾MNC殺傷腫瘤細(xì)胞的作用明