盤(pán)基網(wǎng)柄菌多細(xì)胞發(fā)育期間與gp150蛋白相互作用蛋白的研究.pdf

1、盤(pán)基網(wǎng)柄菌(Dictyostelium discoideum)是一種低等的單細(xì)胞真核生物，在營(yíng)養(yǎng)豐富的條件下能夠依靠吞噬細(xì)菌為食，其繁殖生長(zhǎng)是通過(guò)二分裂的方式。當(dāng)食物逐漸耗盡后，單個(gè)細(xì)胞逐漸聚集成多細(xì)胞體，歷經(jīng)細(xì)胞聚集階段、細(xì)胞丘階段和蛞蝓體階段、最終發(fā)育成一個(gè)由孢子細(xì)胞和柄細(xì)胞組成的多細(xì)胞有機(jī)體-子實(shí)體階段。在合適條件下，孢子細(xì)胞能夠萌發(fā)，從而開(kāi)始新的生命周期。盤(pán)基網(wǎng)柄菌的基因組是單倍體，不會(huì)由于等位基因的存在而掩蓋單基因的突變，因此

2、隱性性狀很容易鑒別，擁有非常豐富的突變型細(xì)胞。盤(pán)基網(wǎng)柄菌發(fā)育周期短，整個(gè)周期約需24h，各階段的特征也很清楚，且涉及到一系列生化過(guò)程與高等生物十分相似。由于具有以上優(yōu)點(diǎn)，盤(pán)基網(wǎng)柄菌可以作為非常好的模式動(dòng)物，在研究細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用以及細(xì)胞黏附分子對(duì)發(fā)育的影響中發(fā)揮重要作用。
　　 盤(pán)基網(wǎng)柄菌中l(wèi)agC基因編碼的gpl50蛋白是一種細(xì)胞表面粘附分子，對(duì)多細(xì)胞發(fā)育和細(xì)胞分化極為重要。gpl50缺失的細(xì)胞株AK127的發(fā)育只能停留

3、在細(xì)胞松散聚集階段，不能完成多細(xì)胞發(fā)育。由此推測(cè)，gpl50蛋白在盤(pán)基網(wǎng)柄菌發(fā)育過(guò)程中起著重要作用。在細(xì)胞分化過(guò)程中，gpl50蛋白的分布存在著差異：在分化成孢子細(xì)胞的前孢子區(qū)內(nèi)基本沒(méi)有g(shù)pl50蛋白分布；而在分化成柄細(xì)胞的前柄細(xì)胞區(qū)則有g(shù)pl50蛋白分布，并隨著發(fā)育進(jìn)程逐漸增加。粘附分子gpl50能傳遞細(xì)胞內(nèi)外的信號(hào)，但是目前為止只有少數(shù)關(guān)于gpl50蛋白參與盤(pán)基網(wǎng)柄菌細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路的報(bào)道，其具體的信號(hào)通路至今仍未完全清楚。為此我

4、們克隆表達(dá)了gpl50蛋白C末端，并用純化的目的蛋白制備多克隆抗體，通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)得到多個(gè)與gpl50分子相關(guān)的蛋白，其中兩個(gè)經(jīng)質(zhì)譜鑒定分別為40S ribosomal protein S3(RPS3)蛋白和40S ribosomal protein S24蛋白(RPS24)。
　　 本論文將含有g(shù)pl50蛋白c末端基因的pET-32a載體轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株大腸桿菌BL21(DE3)中，利用lmmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，最終

5、得到表達(dá)量較高的存在于包涵體中的融合蛋白。用8mol/L的尿素溶解包涵體后，裂解液經(jīng)NI-NTA親合層析純化融合蛋白，最終得到的gpl50融合蛋白純度達(dá)90％以上。利用純化得到的gpl50蛋白作為抗原免疫家兔，從而獲得含有抗gpl50蛋白的多克隆抗體的抗血清。用Western blot檢測(cè)抗體的特異性，抗血清能特異地和目的蛋白結(jié)合，而對(duì)照血清與抗原沒(méi)有雜交帶；用問(wèn)接ELISA法測(cè)定抗體的效價(jià)，達(dá)到1:128000以上，這證明我們制備的多

6、克隆抗體具有較高的效價(jià)和較好的特異性，為下一步的研究工作提供了工具。
　　 為了探索盤(pán)基網(wǎng)柄菌中與gpl50蛋白相互作用的其他蛋白，我們以發(fā)育至16h的盤(pán)基網(wǎng)柄菌為材料，在非變性的條件下提取總蛋白，將制備的抗gpl50的多克隆抗體及Protein A-Agarose加入到總蛋白提取物中。4℃振蕩過(guò)夜，離心分離抗原抗體復(fù)合物，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析得到七條相關(guān)蛋白條帶，其分子量大約在30KD-15KD左右。我們從中選取了較為清

7、晰的兩條條帶（分子量分別為25KD和14KD左右）進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定，結(jié)果分別為40S ribosomal protein S3(RPS3)蛋白和40S ribosomal protein S24蛋白(RPS24)。通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)兩蛋白在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞發(fā)育及凋亡過(guò)程中有著重要作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示在盤(pán)基網(wǎng)柄菌多細(xì)胞發(fā)育中g(shù)pl50蛋白可能與RPS3和RPS24發(fā)生相互作用，借此調(diào)節(jié)了盤(pán)基網(wǎng)柄菌細(xì)胞的發(fā)育與分化過(guò)程。