盤基網(wǎng)柄菌突變細胞亞顯微結(jié)構(gòu)及gp150蛋白原核表達與純化研究.pdf

1、盤基網(wǎng)柄菌（Dictyosteliumdiscoideum）是一種低等的單細胞真核原生生物，隸屬原生動物門網(wǎng)柱超綱．營養(yǎng)豐富的條件下，以單細胞形式存在，在饑餓狀態(tài)下，細胞開始發(fā)生聚集，野生型細胞株KAx-3經(jīng)過細胞聚集階段，細胞丘，蛞蝓體和子實體階段，最終形成由柄細胞和孢子細胞組成的子實體。由于其發(fā)育周期短，生命現(xiàn)象豐富，發(fā)育程序受到精密的調(diào)控，成為了研究細胞分化，細胞發(fā)育，細胞信號傳導、形態(tài)發(fā)生等的良好模式生物。
　　 gpl

2、50是盤基網(wǎng)柄菌細胞丘時期表達的異嗜性粘附分子，是細胞發(fā)育的一種必需分子，在蛋白分類上屬于跨膜蛋白，由LagC基因編碼，一個97kD糖蛋白。gpl50缺失的細胞株AK127缺乏該蛋白，發(fā)育被阻滯在細胞疏松聚集階段，不能完成最終發(fā)育，可見gpl50蛋白在盤基網(wǎng)柄菌發(fā)育過程中起著重要作用，它可能參與介導細胞分化和凋亡的信號轉(zhuǎn)導途徑，但具體的信號通路至今仍未完全清楚。因此本研究一方面通過形態(tài)學研究觀察gpl50缺失的細胞株AK127的超微結(jié)構(gòu)

3、，一方面用分子生物學的手段對gpl50蛋白進行原核表達，為深入探究其結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系提供理論基礎(chǔ)。
　　 野生型細胞發(fā)育14h后，細胞處于發(fā)育關(guān)鍵點，而處在相同發(fā)育時間段的AK127突變細胞的亞顯微結(jié)構(gòu)特征未見有報道，為搞清發(fā)育期間AK127細胞亞顯微結(jié)構(gòu)特征，本研究用透射電鏡觀察了發(fā)育14h、16h、20h的細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：發(fā)育14h細胞內(nèi)含豐富內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)，由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組織圍裹細胞質(zhì)密度明顯低于周圍的細胞質(zhì)，能清楚地觀察到多層膜組成

4、的多膜結(jié)構(gòu)。據(jù)此我們推測多膜結(jié)構(gòu)最早起源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)。發(fā)育到16h時，多膜結(jié)構(gòu)內(nèi)某些膜開始解體，形成自噬泡。自此我們對自噬泡的起源也有了一個較明確的認識。發(fā)育20h細胞內(nèi)有一個內(nèi)含數(shù)個多膜結(jié)構(gòu)的大自噬泡。據(jù)此我們推測多膜結(jié)構(gòu)作為一個儲備營養(yǎng)成分“倉庫”，為維持細胞生命所用。自噬泡僅僅消化多膜的同心圓結(jié)構(gòu)，并不損傷其他細胞器，幫助細胞度過饑餓環(huán)境，其功能與野生型細胞中的自噬泡明顯不同。研究中還發(fā)現(xiàn)細胞核的內(nèi)核膜產(chǎn)生凹陷，使內(nèi)外核膜間產(chǎn)生一

5、個含絲狀物質(zhì)的泡狀空間，內(nèi)核膜上可見螺旋狀染色物質(zhì)，外核膜表面布滿顆粒狀物質(zhì)。這種局部空泡化的細胞核附近出現(xiàn)一些外被一圈顆粒狀物質(zhì)，內(nèi)有低電子密度絲狀物的小泡，而只有出現(xiàn)局部空泡化細胞核周圍才出現(xiàn)上述小泡，因此我們推測這些小泡的出現(xiàn)很有可能是外核膜上布滿顆粒狀物質(zhì)分泌到細胞質(zhì)中導致的結(jié)果。我們觀察到在發(fā)育的各階段，線粒體數(shù)目豐富且嵴完整，既沒有發(fā)生內(nèi)自噬現(xiàn)象，也沒有發(fā)生嵴瓦解現(xiàn)象。這與野生型的線粒體內(nèi)自噬現(xiàn)象形成了對比，說明了線粒體結(jié)構(gòu)

6、變化與細胞分化有一定關(guān)系，突變細胞沒有發(fā)生明顯的細胞分化。這些數(shù)據(jù)為進一步分析gpl50分子在細胞生長和發(fā)育過程中的作用提供了新的資料。
　　 深入研究gp150蛋白結(jié)構(gòu)與功能，無疑會對我們理解細胞粘著及粘附分子在多細胞發(fā)育進程中的作用有重要意義。而探究蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的前提是獲得大量高純度的蛋白，所以，本實驗利用基因工程的方法，將gp150全蛋白在大腸桿菌里進行了可溶性表達，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，含Actin15啟動子的

7、載體可以在大腸桿菌宿主菌BL21中啟動目的基因的表達，目的條帶的量約占全菌蛋白的15％左右。本實驗接著采用離子交換法對gpl50蛋白的純化方法進行了初步探索。選取了CM、DEAE、Q三種離子交換樹脂分別在三個PH梯度吸附條件下進行試驗，由于蛋白表達量未達到理想程度，本實驗室已保存的表達載體Actinl5-LagC不含融合表達標簽，離子交換樹脂吸附的雜蛋白較多，蛋白分離純化效果不理想。由于摸索最佳純化條件還需要較長時間，離子交換法純化蛋白

8、的工作具有較大困難，所以后續(xù)工作用PCR方法從本實驗室已保存的表達載體Actinl5-LagC上擴增LagC基因，將其克隆至pET32a原核表達載體，重新構(gòu)建了重組載體pET32a-LagC，構(gòu)建的重組質(zhì)粒帶有6個組氨酸標簽，經(jīng)測序鑒定讀碼框完整準確，沒有突變，成功地構(gòu)建了gpl50蛋白的原核表達載體，為進一步的蛋白融合表達，純化和高級結(jié)構(gòu)研究打下了基礎(chǔ)，也為研究gpl50蛋白在盤基網(wǎng)柄菌細胞發(fā)育中的作用提供必要前提和有力工具。本研究首

9、次運用了生物信息學的方法對gp150蛋白進行了分析，采用Gamier-Robson和Chou-Fasman兩種方法進行g(shù)pl50蛋白二級結(jié)構(gòu)預測，并應(yīng)用Kyte-Doolittle的親水方案、Emini的蛋白質(zhì)表面可能性方案、Karplus-Sohulz的柔性蛋白預測方案和Jameson-Wolf的抗原指數(shù)方案進行綜合分析，預測結(jié)果表明該蛋白形成a螺旋結(jié)構(gòu)的能力較弱，a螺旋存在于第348-353,598-602，685-688，731～