乙型肝炎病毒Pre-C-BCP突變熱點的焦磷酸測序方法的建立及其可靠性研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(HBV)感染是引起急性肝炎及慢性肝病的主要原因，其長期慢性感染還與肝硬化、肝細胞癌的發(fā)生密切相關(guān)。在全世界，約有3.5億的慢性HBV感染者，而我國就約有1.2億，每年與乙型肝炎相關(guān)的死亡人數(shù)達30萬例左右，占傳染病死亡第一位。HBV作為嗜肝脫氧核糖核酸病毒科中的一員，其復制為逆轉(zhuǎn)錄復制，缺乏校對功能，并在人體免疫、外界藥物等因素的共同影響下，常易發(fā)生變異。其中，Pre-C/BCP的突變最為突出，并在慢性肝病患者中常見。Pr

2、e-C常見突變熱點有G1896A、G1899A，BCP常見突變位點有A1762T、G1764A、C1766T。這些突變不僅可以導致血清中病毒標志物的改變，改變機體對感染細胞的免疫反應(yīng)，還可改變HBV復制能力，如增加HBV病毒的毒力，導致較嚴重的肝病活動，促進慢性肝病向肝硬化及肝癌發(fā)展的進程，與暴發(fā)性肝炎、重型肝病及肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。因此，如何準確可靠地診斷相應(yīng)位點的基因突變，是HBv相關(guān)疾病準確診斷和科學治療的基礎(chǔ)，亦是預(yù)后最重要的參

3、考依據(jù)，故急需建立其相應(yīng)的準確可靠的臨床診斷方法。而目前對于HBV Pre-C/BCP基因突變的檢測的常用檢測方法有DNA測序法、PCR-RFLP(PCR及限制性片段長度多態(tài)性分析法)、熒光實時PCR LightCycler法及基因芯片檢測技術(shù)。這些方法雖都能較好地檢測相應(yīng)的突變，但各有其顯著的不足之處，如PCR-RFLP，PCRLightCycler每次只能檢測一個突變位點，不能同時對多位點突變進行檢測；DNA測序法和基因芯片檢測技術(shù)

4、花費昂貴、步驟煩瑣，距臨床檢測要求都存在著明顯的距離，不能作為常規(guī)臨床檢測技術(shù)而廣泛應(yīng)用于臨床。故急需尋找新的檢測方法和技術(shù)，以滿足臨床工作的需要。 焦磷酸測序作為一種新型DNA測序技術(shù)，可通過檢測DNA合成過程中所釋放的焦磷酸而獲得待測核苷酸序列，具有高準確性、高通量、高自動化、重復性好等優(yōu)點，費用低廉，適合臨床批量檢驗的特點，有望適用于HBV Pre-C/BCP多位點基因突變的檢測。但由于該技術(shù)起步較晚，迄今國內(nèi)外尚未見運用

5、焦磷酸測序技術(shù)對Pre-C/BCP突變位點的檢測的報道。為此，我們在前期研究YMDD焦磷酸測序技術(shù)的基礎(chǔ)上，開展此研究，以期探索一種新的自動化和高通量檢測HBV Pre-C/BCP熱點突變的方法。研究目的： 在我們前期研究YMDD焦磷酸測序技術(shù)的基礎(chǔ)上，以焦磷酸測序技術(shù)為平臺，建立一種檢測Pre-C/BCP突變熱點的檢測方法，并驗證該方法的準確性、重復性、可靠性及進行初步臨床檢測，以期建立一種高效、高通量、自動化、低成本的Pre

6、-C/BCP突變位點的臨床檢測方法。 材料與方法： 1、材料 1．1參考標準品(血清)參考標準品1為6份慢性乙型肝炎患者血清(HBV-DNA定量均大于1×10<'4>)，具有Sanger測序法檢測結(jié)果；參考標準品2為12份慢性乙型肝炎患者血清(HBV-DNA定量均大于1×10<'4>)，具有基因芯片檢測法的結(jié)果。 1．2 PCR擴增及電泳相關(guān)材料核酸提取液，PCR擴增引物，10mm dNTP，10x PC

7、R buffer，瓊脂糖等。 1．3焦磷酸測序相關(guān)材料70﹪乙醇、2×洗滌結(jié)合緩沖液、超級順磁性磁珠、復性緩沖液、SQA Reagent Kit、PSQ96孔板、PSQ 96 Sample Vacuum Prep Tool、PSQ 96 Sample Vacuum PrepWorktable、PSQ96MA測序儀等(Biotage公司)。 1．4臨床待檢血清標本60份慢性乙型肝炎患者血清(HBV-DNA定量均大于1×10

8、<'4>，HBeAg陰性)。 2、方法及觀察項目2．1焦磷酸測序片斷的PCR擴增方法的建立及其PCR擴增產(chǎn)物的檢測先進行梯度PCR擴增，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物是否為本實驗的目標擴增片段及確定最佳退火溫度后，在此基礎(chǔ)上對參考標準品及臨床待檢血清標本的Pre-C/BCP突變區(qū)進行批量化的焦磷酸測序片斷的擴增。 2．2 Pre-C/BCP焦磷酸測序檢測方法的建立對參考標準品1的PCR產(chǎn)物的Pre-C/BCP突變區(qū)進行焦磷酸

9、測序。先將參考標準品1的PCR產(chǎn)物磁珠固定，通過PSQ 96 Sample Vacuum Prep Tool、Worktable及相關(guān)試劑進行堿變性，洗滌，將DNA雙鏈轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂?，再加入測序引物與單鏈退火雜交，最后在PSQ96MA測序儀中進行測序。 2.3焦磷酸測序法的精確性、可靠性、重復性的驗證2.3.1參考標準品的焦磷酸測序結(jié)果分別與Sanger測序法、基因芯片檢測法的結(jié)果進行對照。 2.3.2參考標準品1的90次重

10、復焦磷酸測序結(jié)果進行對照。 2.4臨床待檢血清標本的焦磷酸測序檢測運用焦磷酸測序技術(shù)，一次性對60份臨床待檢血清標本的PCR產(chǎn)物同時進行Pre-C/BCP多個突變位點的檢測。 結(jié)果： 1、焦磷酸測序片斷的擴增方法的建立通過梯度PCR實驗及系列實驗，確定了本研究的最適PCR條件為：最佳退火溫度為54℃后，獲得了約260bp的目標片斷，并在此基礎(chǔ)上對參考標準品及臨床待檢血清進行批量化的焦磷酸測序片斷的擴增，結(jié)果顯示1

11、0<'4>滴度水平以上的78例HBV血清標本均獲得了有效擴增，陽性率達100﹪。 2、Pre-C/BCP焦磷酸測序檢測方法的建立首先應(yīng)用焦磷酸測序?qū)⒖紭藴势?的PCR產(chǎn)物進行檢測，成功建立了Pre-C/BCP焦磷酸測序檢測方法，其結(jié)果與Sanger。法測序結(jié)果的符合率為100﹪，提示焦磷酸測序技術(shù)是一種高精確性的檢測技術(shù)。 3、參考標準品2的焦磷酸測序檢測結(jié)果及相符性分析參考標準品2的焦磷酸測序結(jié)果與其既往3個月內(nèi)的基

12、因芯片檢測結(jié)果的符合率達11/12，僅有1例不符合，不排除該例存在繼發(fā)突變可能。由此可見，焦磷酸測序技術(shù)是一種可與基因芯片檢測技術(shù)相媲美的，準確率高的臨床檢測方法。 4、焦磷酸測序技術(shù)的可靠性、重復性驗證本實驗對參考標準品1進行90次重復焦磷酸測序，其測序結(jié)果符合率為100﹪，表明了焦磷酸測序技術(shù)是一種檢出率高，重復性好的可靠的檢測技術(shù)。 5、臨床待檢血清標本的焦磷酸測序檢測在前述研究的基礎(chǔ)上，我們一次性對60份標本的多位點突變

13、進行測序檢測，結(jié)果顯示：共檢出60例，26例有位點突變，其中一例還發(fā)現(xiàn)了T1758C突變。結(jié)果表明：本實驗建立的基于焦磷酸測序技術(shù)的Pre-C/BCP突變檢測技術(shù)，在臨床標本檢測中，亦達到了高通量、多位點及自動化的檢測目的，有望成為一種新的臨床檢測方法。結(jié)論： 本實驗針對臨床急需的Pre-C/BCP基因突變的檢測所建立的焦磷酸測序技術(shù)是一種準確性高、重復性好、可靠性強、可一次性檢測HBV Pre-C/BCP多位點突變的高通量的檢