乙型肝炎病毒pre-S-S基因突變與異常血清學(xué)診斷模式的相關(guān)性研究.pdf

1、HBV感染是全球性健康問(wèn)題，我國(guó)更是一個(gè)HBV高感染地區(qū)。HBV屬嗜肝DNA病毒科，基因組長(zhǎng)約3.2kb，為部分雙鏈環(huán)狀DNA，分為A～H8個(gè)基因型，各基因型又可分為不同基因亞型。各基因型具有不同的地理分布，亞洲感染者主要感染的是基因型B和C。HBV前S/S(pre-S/S)區(qū)編碼大、中、小3種表面蛋白。盡管HBV是DNA病毒，但它特有的一些特征使它的突變幾率遠(yuǎn)遠(yuǎn)比別的DNA病毒高。在HBV’感染者體內(nèi)，突變株往往與野生型病毒一起成為混

2、合病毒群。HBV的基因變異對(duì)分子生物學(xué)和免疫學(xué)分析的敏感性提出了挑戰(zhàn)。pre-S/S基因突變給乙型肝炎的實(shí)驗(yàn)診斷、治療及判斷預(yù)后帶來(lái)許多臨床問(wèn)題。診斷HBV感染的免疫學(xué)試驗(yàn)是檢測(cè)一系列HBV免疫學(xué)標(biāo)志物。病毒基因的變異所致的一系列病毒表型的改變，使人們對(duì)免疫學(xué)診斷提出質(zhì)疑。在我們?nèi)粘５膶?shí)驗(yàn)診斷工作中經(jīng)常會(huì)遇到異常的HBV血清學(xué)診斷模式，包括：HBsAg和HBsAb同時(shí)存在，乙肝五項(xiàng)中僅HBcAb強(qiáng)陽(yáng)性，乙肝五項(xiàng)中僅HBeAb強(qiáng)陽(yáng)性，HB

3、sAg陰性但HBeAg陽(yáng)性，不同診斷試劑診斷HBsAg結(jié)果不一致。這些血清學(xué)診斷模式的異?？赡芘cHBV pre-S/S基因突變有關(guān)。常用的血清學(xué)診斷方法在遇到影響抗原決定簇構(gòu)象、抗原不表達(dá)或分泌缺陷等基因突變時(shí)，會(huì)出現(xiàn)檢測(cè)失敗。pre-S/S基因變異可導(dǎo)致免疫逃避、隱匿性HBV感染，血清學(xué)檢測(cè)時(shí)表現(xiàn)為HBsAg和HBsAb同時(shí)存在或HBsAg陰性。許多年來(lái)，人們都以病人血清中HBsAg作為HBV感染的特征，HBVpre-S/S基因突變對(duì)

4、HBsAg檢測(cè)和其他HBV血清學(xué)標(biāo)記物的影響及其相關(guān)性需要進(jìn)一步研究。 HBVpre-s突變和“a”決定簇內(nèi)部的突變對(duì)于免疫逃避和隱匿性感染的影響在不同國(guó)家和地區(qū)的研究結(jié)論并不相同。通常認(rèn)為“a”決定簇內(nèi)部的突變，尤其是G145R突變是免疫逃避的主要突變位點(diǎn)。有關(guān)東亞地區(qū)的HBVpreS/S突變數(shù)據(jù)采集主要來(lái)自于日本、中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)、韓國(guó)，這提示在中國(guó)pre-S和S區(qū)基因突變研究數(shù)據(jù)不多，本地區(qū)(即中國(guó)大陸)preS/S突變發(fā)生位

5、點(diǎn)及preS/S突變與HBV血清學(xué)異常檢測(cè)模式的關(guān)系尚需研究。本研究旨在通過(guò)對(duì)各種異常HBV血清學(xué)檢測(cè)模式的標(biāo)本進(jìn)行S基因分型和pre-S/S區(qū)突變分析，提供本地區(qū)HBV基因型和突變株流行病學(xué)數(shù)據(jù)，探討pre-S/S基因突變與各種異常血清學(xué)診斷模式的關(guān)系，分析pre-S/S基因突變對(duì)實(shí)驗(yàn)診斷結(jié)果的影響和造成免疫逃避和隱匿性HBV感染的各種因素。 本研究收集了臨床五種異常HBV血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)本，并以具有常見(jiàn)血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)本

6、作為對(duì)照組。采用DNA定量檢測(cè)方法篩選HBVDNA陽(yáng)性的標(biāo)本。應(yīng)用病毒核酸提取效率較高的方法提取收集血清的HBVDNA。設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到各模板中HIBVpre-S/S擴(kuò)增產(chǎn)物，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。通過(guò)PCR產(chǎn)物直接測(cè)序或克隆測(cè)序的方法得到各標(biāo)本中HBVpre-S/S基因序列，進(jìn)而進(jìn)行S基因分型和pre-S/S區(qū)缺失突變和點(diǎn)突變分析。采用非參數(shù)假設(shè)檢驗(yàn)方法-Wilcox ranksum test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，討論pr

7、e-S/S區(qū)突變與各種異常血清學(xué)檢測(cè)模式的關(guān)系。 根據(jù)血清學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和核酸檢測(cè)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)標(biāo)本可被分為三部分進(jìn)行分析。 第一部分為HBsAg和HBsAb檢測(cè)同時(shí)陽(yáng)性的標(biāo)本。測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)這些標(biāo)本中存在pre-S缺失突變、pre-S2起始密碼子突變和“a’決定簇中少數(shù)位點(diǎn)的點(diǎn)突變，其中2例標(biāo)本出現(xiàn)G145R/A突變。與對(duì)照組(HBsAg陽(yáng)性而HBsAb陰性的標(biāo)本＞比較發(fā)現(xiàn)pre-S缺失突變與HBsAg和HBsAb同時(shí)存在具有一

8、定統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(P=0.024)，而pre-S2起始密碼子突變和“a”決定簇點(diǎn)突變與這種檢測(cè)模式不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(P=0.571，P=0.408)。pre-S缺失突變主要發(fā)生在pre-S13’端和pre-S25’端，3例標(biāo)本中pre-S13’端大片段缺失突變株與野生型共同存在。pre-S缺失突變通過(guò)影響HBV多個(gè)功能位點(diǎn)從而形成體內(nèi)的免疫逃避，造成HBsAg和HBsAb檢測(cè)同時(shí)陽(yáng)性。 第二部分為 HBsAg陰性但HBVDNA陽(yáng)

9、性的標(biāo)本，其中包括HBsAg陰性但HBeAg陽(yáng)性的檢測(cè)模式、乙肝五項(xiàng)中僅HBcAb強(qiáng)陽(yáng)性或僅HBeAb強(qiáng)陽(yáng)性的檢測(cè)模式。僅HBcAb強(qiáng)陽(yáng)性或僅HBeAb強(qiáng)陽(yáng)性的檢測(cè)模式中發(fā)現(xiàn)HBV隱匿性感染的存在，比率分別為1.6％和3.3％。測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)pre-S缺失突變、pre-S2起始密碼子突變和“a”決定簇中的點(diǎn)突變與HBsAg血清學(xué)檢測(cè)失敗均有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(P=0.033，P=0.033，P=0.033)。“a”決定簇的點(diǎn)突變中2例

10、標(biāo)本出現(xiàn)G145R/A突變。突變株存在多重突變和混合感染，但結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)造成HBsAg漏檢的原因不僅僅是pre-S/S突變，循環(huán)中HBsAg水平低于檢測(cè)限也是另外一個(gè)重要的漏檢原因。 第三部分為不同診斷試劑診斷HBsAg結(jié)果不一致的標(biāo)本。核酸檢測(cè)均為陰性，未發(fā)現(xiàn)pre-S/S基因突變。這一部分標(biāo)本核酸檢測(cè)的陰性結(jié)果可能與標(biāo)本選擇的局限性有關(guān)。 本研究結(jié)果表明由于HBV在體內(nèi)長(zhǎng)期存在和免疫壓力下，慢性HBV感染者可以通過(guò)p

11、re-S/S基因突變導(dǎo)致免疫逃避，形成HBsAg和HBsAb同時(shí)陽(yáng)性的檢測(cè)結(jié)果，pre-S缺失突變與這種檢測(cè)模式具有相關(guān)性。文獻(xiàn)報(bào)道“a”決定簇點(diǎn)突變與這種模式具有相關(guān)性，而在本研究中并未得到相同結(jié)論。臨床免疫檢測(cè)中HBsAg漏檢的原因可能是由于pre-S/S基因突變引起抗原決定簇構(gòu)象變化或影響抗原的分泌表達(dá)而造成的，本研究表明pre-S缺失突變、pre-S2起始密碼子突變和“a”決定簇中的點(diǎn)突變均與HBsAg漏檢具有相關(guān)性，但循環(huán)中H

12、BsAg水平低于檢測(cè)限也是另外一個(gè)重要的原因。本研究中發(fā)現(xiàn)的“a”決定簇點(diǎn)突變主要在以下位點(diǎn)： I/T126S/N/L、Q129N/R/P/H、D144E/G、G145R/A、G130N、T131N和M133T/I。在異常血清學(xué)檢測(cè)模式中，pre-S/S突變往往表現(xiàn)為多重變異以及不同突變株或突變株與野生型的混合感染。與報(bào)道相比，作為免疫逃避主要突變位點(diǎn)的G145R突變并不常見(jiàn)。關(guān)于HBV preS/S基因突變與免疫逃避的關(guān)系，目前不同的

13、研究有不同的結(jié)論，這可能與不同地域HBV流行株變異有關(guān)。換言之，免疫壓力下不同基因型或基因亞型可能產(chǎn)生不同類(lèi)型的突變。本研究中pre-S缺失突變和pre-S2起始密碼子突變?nèi)堪l(fā)生在基因型C中。 總之，異常血清學(xué)檢測(cè)模式往往與HBVpre-S/S基因突變相關(guān)，DNA檢測(cè)和突變株檢測(cè)對(duì)于這些標(biāo)本尤為重要。pre-S/S基因突變可造成HBsAg血清學(xué)漏檢，HBV低水平攜帶者的低抗原量造成的漏檢同樣值得注意。HBV隱匿性感染不僅可以造