膽道癌全基因組雜交分析的研究.pdf

1、背景膽道癌(BiliarytractcarcinomaBTC)包括膽囊癌(GallbladderCarcinomaGBC)和膽管癌(BileductcarcinomaBDC)，由于膽道癌難以早期發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)癥狀時往往已處于中晚期，手術(shù)根治率低、預(yù)后差。因此膽道癌的分子生物學(xué)研究日益受到人們的重視，希望能夠從分子水平上找出膽道癌的發(fā)生、發(fā)展的原因，以提高膽道癌的早期診治水平。 膽道癌的發(fā)病機(jī)理尚不清楚，目前的研究提示可能與多基因、多

2、步驟協(xié)同作用有關(guān)。以前對膽道腫瘤的細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究，主要集中在單個或幾條基因的改變，如目前研究較多的與膽道癌相關(guān)的癌基因有ras、c-erbB-2、bcl-2、c-myc、bax，HER-2/neu，c-met及Fas基因等，抑癌基因有p53、p16、nm23、p27，DPC4及Rb基因等；但是對于染色體上全基因組的增加卻知道得很少。而且，促進(jìn)膽道腫瘤發(fā)生和發(fā)展的分子學(xué)基礎(chǔ)至今還不清楚。 比較基因組雜交(Compara

3、tiveGenomicHybridization，CGH)是一種將原位熒光雜交技術(shù)(FluorescenceinSituHybridization，F(xiàn)ISH)與數(shù)字圖像分析相結(jié)合，用于檢測腫瘤組織DNA異常(缺失、擴(kuò)增)，并在染色體上定位的分子細(xì)胞遺傳學(xué)方法。與傳統(tǒng)的分子水平的DNA檢測手段相比，在一次試驗中即可對整個基因組進(jìn)行分析，可以提供一個全基因組的“掃描圖”，形象地表現(xiàn)出腫瘤DNA在整個染色體組的哪個特定位置存在缺失，這些部位即

4、可能包含一些抑癌基因，而發(fā)生擴(kuò)增的位置極可能存在致癌基因。 基因芯片(Microarray)技術(shù)是九十年代初隨著人類基因組計劃發(fā)展起來的一門新技術(shù)，它的出現(xiàn)使基因序列測定、基因功能測定等工作的程序得到了極大的簡化，在一次實驗中能夠同時對成千上萬條基因的表達(dá)進(jìn)行檢測?；蛐酒夹g(shù)具有低消耗、高靈敏度、高通量地分析細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)譜的特點。 本實驗?zāi)康模簯?yīng)用比較基因組雜交技術(shù)檢測膽囊癌和膽管癌基因組DNA拷貝浙江省科技廳重點

5、課題編號2003cj053數(shù)的增加和丟失的變化特征和規(guī)律，尋找和定位與膽囊癌和膽管癌變相關(guān)的癌基因和抑癌基因，加深對膽道癌癌變機(jī)制的了解。同時應(yīng)用表達(dá)譜基因芯片獲得膽囊癌的基因轉(zhuǎn)錄圖譜，基于染色體定位信息整合染色體與轉(zhuǎn)錄水平的信息，初步篩選與膽囊癌相關(guān)的候選腫瘤相關(guān)基因，從分子水平理解膽囊癌的病因，尋找理想的膽囊癌標(biāo)記物和探索基因治療的靶點。 方法1.比較基因組雜交研究膽道癌染色體DNA拷貝數(shù)變化：28例膽囊癌和18例膽管癌患者

6、的新鮮標(biāo)本均來自浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院和附屬邵逸夫醫(yī)院2003年10月至2005年8月間手術(shù)患者，均得到病理學(xué)檢查證實，所有患者術(shù)前均未進(jìn)行過放療和化療。 2.膽囊癌相關(guān)腫瘤基因的初步篩選：選取4例新鮮膽囊癌組織標(biāo)本和對應(yīng)的正常對照組織，提取總RNA，分別標(biāo)記熒光探針后與含4069個基因的BiostarH-40s型腫瘤表達(dá)譜芯片雜交，雜交后進(jìn)行圖像掃描和數(shù)據(jù)分析，獲得膽囊癌的基因轉(zhuǎn)錄圖譜，篩選4例標(biāo)本共同的差異表達(dá)基因，并且這些基

7、因在染色體上精確定位，結(jié)合4例標(biāo)本比較基因組雜交提供的染色體信息，整合膽囊癌染色體與轉(zhuǎn)錄水平的信息，初步篩選與膽囊癌相關(guān)的可能候選腫瘤相關(guān)基因。 結(jié)果1.比較基因組雜交分析膽道癌染色體拷貝數(shù)特征：28例膽囊癌染色體DNA拷貝數(shù)的增加和丟失數(shù)目總計分別為157和114。每個患者平均DNA拷貝數(shù)增加和丟失的頻率分別為5.6和4.1。結(jié)果顯示有多條染色體特定帶上出現(xiàn)腫瘤組織雜交信號增強(qiáng)，其中增加超過20％的染色體區(qū)域有7p(54％，1

8、5/28)，7q(50％，14/28)，8q(46％，13/28)，17q(36％，10/28)，5p(36％，10/28)，11q(32％，9/28)，1q(29％，8/28)，9q(21％，6/28)，16q(21％，6/28)，其中最小重疊區(qū)域在7p12-p15，7q31-q35，8q21.3-q24.1，17q21-q24，5p12-p15.1，11q12-q22，1q23-q24，9q11-q13，16q11-q12，說明這些

9、區(qū)域中存在與膽囊癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的癌基因。多條染色體的特定區(qū)帶存在腫瘤組織DNA雜交信號明顯減弱和缺失，其中包括17p(43％，12/28)，9p(36％，10/28)，5q(29％，8/28)，6q(25％，7/28)，3p(18％，5/28)，15p(18％，5/28)，13p(18％，5/28)，其中最小重疊區(qū)域在17p12-p13，9p21-p23，5q23-q32，6q16-q22，3p13-p21，15p11.2-pter，1

10、3p12-p13。 在18例膽管癌樣本中，DNA拷貝數(shù)的增加和丟失數(shù)目總計分別為89和67。每個患者平均DNA拷貝數(shù)增加和丟失的頻率分別為4.9和3.7。 統(tǒng)計學(xué)分析表明膽囊癌和膽管癌在1q，5p，8q，17q的擴(kuò)增和5q，9p，17p上的丟失無顯著性差異(p＞0.05)，而膽囊癌7p，7q的擴(kuò)增顯著高于膽管癌(p＜0.05)，而膽管癌20q的擴(kuò)增，3p，18q缺失顯著高于膽囊癌(p＜0.05)。 2.膽囊癌相關(guān)

11、腫瘤基因的初步篩選：表達(dá)譜基因芯片共篩查出共同表達(dá)的異?；?1條，涉及腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個方面。其中表達(dá)下調(diào)的基因17調(diào)，表達(dá)上調(diào)的基因44條。結(jié)合4例標(biāo)本CGH提供的染色體DNA拷貝數(shù)異常區(qū)域(擴(kuò)增和丟失)，整合膽囊癌染色體DNA水平與轉(zhuǎn)錄水平的信息，初步篩選與膽囊癌相關(guān)的可能候選腫瘤基因共有21條，具體包括癌基因2條；抑癌基因1條；細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因2條；DNA修復(fù)和重組基因1條；細(xì)胞信號和傳遞基因4條；代謝相關(guān)基因4條；蛋白翻譯合

12、成基因3條；其它功能未明確基因4條。 結(jié)論：1.腫瘤DNA拷貝數(shù)增加常與癌基因擴(kuò)增有關(guān)，而DNA拷貝數(shù)丟失常與抑癌基因失活相關(guān)；本研究發(fā)現(xiàn)，染色體7p是膽囊癌染色體DNA拷貝數(shù)增加頻率最高的部位，7q和8qDNA拷貝數(shù)增加的頻率也很高，膽囊癌染色體DNA拷貝數(shù)的丟失頻率最高的是17p，9p也是DNA拷貝數(shù)丟失頻率最常見的部位，這些重要的發(fā)現(xiàn)提示7p，7q和8q部位可能存在與膽囊癌變密切相關(guān)的癌基因，17p和9p可能存在與膽囊癌變

13、密切相關(guān)的抑癌基因。 2.本研究發(fā)現(xiàn)染色體8q是膽管癌染色體DNA拷貝數(shù)的增加頻率最高的部位，其次20q和5pDNA拷貝數(shù)增加的頻率也很高，膽管癌染色體DNA拷貝數(shù)高頻率丟失在3p和17p，18q，這些重要的發(fā)現(xiàn)提示8q，20q和5p可能存在與膽管癌變密切相關(guān)的癌基因，3p，17p和18q可能存在與膽管癌變密切相關(guān)的抑癌基因。 3.本研究發(fā)現(xiàn)膽囊癌和膽管癌組織發(fā)生DNA拷貝數(shù)增加和丟失的染色體區(qū)域不完全相同，DNA拷貝數(shù)

14、增加常與癌基因擴(kuò)增有關(guān)，而DNA拷貝數(shù)丟失常與抑癌基因失活相關(guān)，膽道癌DNA拷貝數(shù)共同高頻率增加的區(qū)域是染色體1q，5p，8q，17q共同丟失在5q，9p，17p。對于膽囊癌來說區(qū)別于膽管癌的高頻率擴(kuò)增的區(qū)域在7p，7q，而膽管癌以20q為特色，膽管癌在3p，18q區(qū)域的缺失顯著高于膽囊癌。這一重要發(fā)現(xiàn)提示，膽囊癌和膽管癌變可能具有不同的分子基礎(chǔ)和遺傳學(xué)背景。這些結(jié)果為進(jìn)一步篩選、定位和克隆與膽道癌相關(guān)的癌基因和抑癌基因提供了重要的理論