己酮可可堿對(duì)氯化鋰—匹羅卡品所致癲癇發(fā)作大鼠黑質(zhì)—尾殼核多巴胺能神經(jīng)元的改善作用.pdf

1、癲癇(Epilepsy, EP)是一反復(fù)發(fā)作、大腦神經(jīng)元異常猝發(fā)放電導(dǎo)致的短暫或持續(xù)性腦功能失常為特征的慢性疾病。研究發(fā)現(xiàn)，癲癇發(fā)作(epileptic seizure，ES)與腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)體系(dopaminergic system)密切相關(guān)。癲癇發(fā)作大鼠腦內(nèi)多巴胺(dopamine，DA)受體密度發(fā)生了明顯改變，癲癇患者腦脊液內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物高香草酸(HVA)含量顯著下降，抗癲癇治療后含量有所升高，暗示DA能神經(jīng)體系在癲癇發(fā)作

2、過(guò)程中受到了損害。目前癲癇發(fā)生的機(jī)制尚不明確，有研究證實(shí)癲癇持續(xù)狀態(tài)下腦內(nèi)神經(jīng)元的過(guò)度放電與氧自由基的生成有關(guān)，F(xiàn)reitas等人的研究證實(shí)了活性氧自由基對(duì)癲癇發(fā)作大鼠神經(jīng)元的損傷作用。因此，通過(guò)抑制過(guò)度活動(dòng)的神經(jīng)化學(xué)通路可減少氧自由基的產(chǎn)生，減輕神經(jīng)元的損傷，進(jìn)而改善癲癇發(fā)作相關(guān)的癥狀，這可能是癲癇治療的途徑之一。
　　己酮可可堿（Pentoxifylline，PTX）是一種非選擇性磷酸二酯酶抑制劑，具有強(qiáng)抗氧化作用，可清除體內(nèi)

3、的氧自由基。PTX最初用于外周血管和呼吸系統(tǒng)疾病的治療。近期研究發(fā)現(xiàn)，PTX可用于治療缺血性腦損傷和中風(fēng)等神經(jīng)系統(tǒng)疾病;此外Geanne等發(fā)現(xiàn)PTX可以改善谷氨酸所致海馬損傷大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力;幼鼠預(yù)先腹腔注射PTX，可降低氯化鋰-匹羅卡品(lithium-pilocarpine，Li-Pc)誘發(fā)癲癇的發(fā)作率，減輕癲癇發(fā)作程度，具有一定的抗癲癇和神經(jīng)保護(hù)作用。癲癇發(fā)作過(guò)程中黑質(zhì)-尾殼核(SN-CPu) DA能神經(jīng)元受到損傷，PTX是否

4、對(duì)癲癇發(fā)作過(guò)程中SN-CPuDA能神經(jīng)元的損傷有改善作用目前尚未有研究顯示。
　　癲癇發(fā)作起病突然，且常為院外發(fā)作，發(fā)作持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)，腦內(nèi)神經(jīng)元損傷越嚴(yán)重，甚至?xí)＜盎颊叩纳?，及時(shí)有效地終止癲癇發(fā)作可以減輕腦內(nèi)神經(jīng)元損傷，提高患者的生活質(zhì)量。目前有研究通過(guò)鼻腔給藥方式治療癲癇發(fā)作，鼻腔給藥既方便又快捷，是某些藥物制劑首選的給藥方法，但目前尚不確定預(yù)先鼻腔給予PTX對(duì)癲癇發(fā)作是否有效。Li-Pc所致大鼠癲癇模型表現(xiàn)出海馬門(mén)區(qū)神經(jīng)元

5、的死亡及苔蘚纖維的出芽，具有與人類(lèi)顳葉癲癇相似的病理和臨床特征，是理想的顳葉癲癇模型，適用于探討癲癇形成機(jī)理及篩選抗癲癇藥物。
　　因此，本課題以Li-Pc所致癲癇發(fā)作大鼠為動(dòng)物模型，利用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR、免疫印跡和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，檢測(cè)反映DA能神經(jīng)元功能活動(dòng)強(qiáng)弱的相關(guān)指標(biāo)，探討預(yù)先腹腔和鼻腔給予PTX對(duì)大鼠SN-CPu處DA能神經(jīng)元功能活動(dòng)的影響，期望所獲結(jié)果為癲癇發(fā)作的防治提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的:觀察PTX對(duì)于

6、癲癇發(fā)作大鼠SN-CPu處DA能神經(jīng)元的影響，探討腹腔和鼻腔兩種PTX給藥方式對(duì)癲癇發(fā)作大鼠SN-CPu處DA能神經(jīng)元的影響效果，期望所獲結(jié)果為癲癇發(fā)作及其治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:將雄性Wistar大鼠(300g左右)隨機(jī)分為腹腔給藥組和鼻腔給藥組。(1)腹腔給藥組:50只大鼠被隨機(jī)分為5組，即空白對(duì)照組(Con.ip)、氯化鋰組(Li.ip)、PTX腹腔給藥對(duì)照組(PTX.ip)、癲癇組(ES.ip)、PTX腹腔給藥

7、組(ES+PTX.ip)。Con.ip組和PTX.ip腹腔注射生理鹽水（127mg/kg），Li.ip組腹腔注射氯化鋰（127mg/kg）;ES.ip和ES+PTX.ip用Li-Pc誘導(dǎo)癲癇發(fā)作，先腹腔注射氯化鋰（127mg/kg），20h后腹腔注射匹羅卡品（15mg/kg）;PTX.ip和ES+PTX.ip在匹羅卡品注射前30 min分鐘通過(guò)腹腔給予PTX（60mg/kg）。每組10只（5只用于液質(zhì)聯(lián)用和實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR，5只用于

8、免疫印跡）。(2)鼻腔給藥組:50只大鼠被隨機(jī)分為5組，即空白對(duì)照組(Con.in)、氯化鋰組(Li.in)、PTX鼻腔給藥對(duì)照組(PTX.in)、癲癇組(ES.in)、PTX鼻腔給藥組(ES+PTX.in)。鼻腔給藥組:Con.in組和PTX.in腹腔注射生理鹽水(127mg/kg)，Li.in組腹腔注射（127mg/kg）;ES.in和ES+PTX.in用Li-Pc誘導(dǎo)癲癇發(fā)作，先腹腔注射氯化鋰（127mg/kg），20h后腹腔注射

9、匹羅卡品（15mg/kg）;PTX.in和ES+PTX.in在匹羅卡品注射前30 min分鐘通過(guò)鼻腔給予PTX(60mg/kg)。每組10只（5只用于液質(zhì)聯(lián)用和實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR，5只用于免疫印跡）。
　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模成功后第八天，通過(guò)實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR和免疫印跡檢測(cè)經(jīng)腹腔和鼻腔預(yù)先給予PTX兩種給藥方式對(duì)癲癇大鼠SN-CPu處酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH) mRNA和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(dopami

10、netransporter, DAT) mRNA及TH和DAT表達(dá)的影響，并通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)經(jīng)腹腔和鼻腔預(yù)先給予PTX兩種給藥方式對(duì)癲癇大鼠SN-CPu處DA及其代謝產(chǎn)物的作用。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)腹腔給予PTX對(duì)SN-CPu處DA能神經(jīng)元的影響
　　1.1 實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果通過(guò)實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR，我們檢測(cè)了大鼠SN處TH mRNA和DATmRNA表達(dá)的變化。與Con.ip組相比，PTX.ip組大鼠SN的

11、TH mRNA和DAT mRNA的相對(duì)表達(dá)分別升高了19％(P＜0.01)和16％(P＜0.01);與Con.ip組相比，ES.ip大鼠SN的TH mRNA和DAT mRNA相對(duì)表達(dá)分別降低了28％(P＜0.01)和26％(P＜0.01);與ES.ip組相比，ES+PTX.ip的TH mRNA和DAT mRNA的相對(duì)表達(dá)分別升高了30％(P＜0.01)和34％（P＜0.01），接近正常水平。
　　1.2 免疫印跡結(jié)果經(jīng)腹腔給予PT

12、X對(duì)TH表達(dá)的影響:與Con.ip組相比，PTX.ip組大鼠TH在SN、CPu的相對(duì)表達(dá)分別升高了31％(P＜0.05)、21％(P＜o(jì).05);與Con.ip組相比，ES.ip組SN、CPu處TH的相對(duì)表達(dá)分別降低了48％(P＜0.01)、45％(P＜0.01);與ES.ip組相比，ES+PTX.ip組的SN、CPu處TH的相對(duì)表達(dá)分別升高了91％(P＜0.01)、89％(P＜0.05)，接近Con.ip組水平。
　　經(jīng)腹腔給予

13、PTX對(duì)DAT表達(dá)的影響:與Con.ip組相比，PTX.ip組大鼠SN、CPu處糖基化DAT(Glycosylated-DAT，Glyco-DAT)的相對(duì)表達(dá)分別升高了26％(P＜0.05)、9％(P＜0.05);與Con.ip組相比，ES.ip組在SN、CPu處Glyco-DAT的相對(duì)表達(dá)分別降低了54％(P＜0.01)、46％（P＜0.01）;與ES.ip組相比，ES+PTX.ip組的SN、CPu處Glyco-DAT的相對(duì)表達(dá)分別升

14、高了114％(P＜0.01)、73％(P＜0.01)，接近于Con.ip組水平。各組間非糖基化DAT(Non-Glycosylated-DAT, Non-Glyco-DAT)的相對(duì)表達(dá)沒(méi)有顯著改變。
　　1.3 液質(zhì)聯(lián)用結(jié)果液質(zhì)聯(lián)用結(jié)果分析發(fā)現(xiàn):與Con.ip組相比，PTX.ip組大鼠CPu處DA、二羥苯乙酸(dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC)和HVA水平分別升高了11％(P＜0.05)、14％(P

15、＜0.05)和17％(P＜0.05);與Con.ip組相比，ES.ip組大鼠CPu處DA、DOPAC和HVA水平分別降低了41％（P＜0.01）、45％(P＜0.01)和47％(P＜0.01);與ES.ip組相比，ES+PTX.ip組大鼠的DA、DOPAC和HVA水平分別升高了65％（P＜0.01）、56％（P＜0.01）和53％(P＜0.01)，DA含量接近正常水平，DOPAC和HVA水平仍明顯低于Con.ip組。
　　ES+P

16、TX.ip組大鼠的(DOPAC+ HVA)/DA、DOPAC/DA和HVA/DA相對(duì)值均比Con.ip大鼠分別降低了9％(P＜0.05)、8％(P＜0.05)和12％(P＜0.05)。其余各組間無(wú)明顯差異。
　　2.經(jīng)鼻腔給予PTX對(duì)SN-CPu處DA能神經(jīng)元的影響
　　2.1 實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果與Con.in組相比，PTX.in組大鼠SN的TH mRNA和DAT mRNA的相對(duì)表達(dá)分別升高了18％(P＜0.05)和2

17、1％(P＜0.01);與Con.in組相比，ES.in大鼠SN的TH mRNA和DAT mRNA的相對(duì)表達(dá)分別降低了28％(P＜0.01)和32％(P＜0.01);與ES.in組相比，ES+PTX.in的TH mRNA和DAT mRNA的相對(duì)表達(dá)分別升高了35％(P＜0.01)和48％(P＜0.01)，接近正常水平。
　　2.2 免疫印跡結(jié)果經(jīng)鼻腔給予PTX對(duì)TH表達(dá)的影響:與Con.in組相比，PTX.in組大鼠TH在SN、CP

18、u的相對(duì)表達(dá)分別升高了21％(P＜0.05)、18％(P＜0.05);與Con.in組相比，ES.in組SN、CPu處TH的相對(duì)表達(dá)分別降低了59％(P＜0.01)、51％(P＜0.01);與ES.in組相比，ES+PTX.in組的CPu、SN處TH的相對(duì)表達(dá)升高，接近于正常水平。
　　經(jīng)鼻腔給予PTX對(duì)DAT表達(dá)的影響:與Con.in組相比，PTX.in組大鼠CPu、SN的Glyco-DAT的相對(duì)表達(dá)分別升高了43％(P＜0.0

19、1)、17％(P＜0.01);與Con.in組相比，ES.in組在CPu、SN處的Glyco-DAT的相對(duì)表達(dá)分別降低了57％(P＜0.01)、53％(P＜0.01);與ES.in組相比，ES+PTX.in組的CPu、SN處Glyco-DAT的相對(duì)表達(dá)分別升高了138％(P＜0.01)、117％(P＜0.01)，接近于Con.in組。各組間Non-Glyco-DAT在CPu和SN的相對(duì)表達(dá)無(wú)明顯差異。
　　2.3 液質(zhì)聯(lián)用結(jié)果與C

20、on.in組相比，PTX.in組大鼠CPu的DA、DOPAC和HVA水平分別升高了12％(P＜0.05)、15％(P＜0.05)和13％(P＜0.01);與Con.in組相比，ES.in組大鼠CPu的DA、DOPAC和HVA水平分別降低了43％(P＜0.01)、36％(P＜0.01)和45％(P＜0.01)。經(jīng)鼻腔給予癲癇大鼠PTX后，ES+PTX.in組大鼠的DA水平和DOPAC和HVA水平接近Con.in組，比ES.in組大鼠分別升

21、高了68％(P＜0.01)、40％(P＜0.01)和69％(P＜0.01)。五組間(DOPAC+ HVA)/DA、DOPAC/DA和HVA/DA相對(duì)值無(wú)明顯差異。
　　3.經(jīng)腹腔和鼻腔兩種給藥途徑，各個(gè)觀察指標(biāo)在空白對(duì)照組與Li組之間均無(wú)明顯改變。
　　4.腹腔和鼻腔給予PTX對(duì)SN-CPu處DA能神經(jīng)元影響的比較通過(guò)實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR和免疫印跡觀察了SN和CPu處THmRNA、DAT mRNA、TH和DAT的表達(dá)改變;通

22、過(guò)液質(zhì)聯(lián)用分析了CPu處DA及其代謝產(chǎn)物DOPAC和HVA的含量及相對(duì)比值。鼻腔給予PTX使各觀察指標(biāo)恢復(fù)到正常水平;腹腔給藥組僅增加了DOPAC和HVA的含量，未恢復(fù)到正常水平，其余各指標(biāo)恢復(fù)至正常水平。
　　結(jié)論:
　　1.PTX增強(qiáng)大鼠SN-CPu處DA能神經(jīng)元的功能活動(dòng)。
　　2.Li-Pc所致癲癇發(fā)作的大鼠SN-CPu處DA能神經(jīng)元的功能活動(dòng)減弱。
　　3.鼻腔給予PTX對(duì)Li-Pc所致癲癇發(fā)作大鼠SN