新生兔缺氧缺血性腦損傷細胞凋亡的基礎與影像學實驗研究.pdf

1、新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)是由于新生兒窒息，引起腦血供和氣體交換障礙所致的一種全腦性損傷，是嚴重危害新生兒生命健康的疾病，有較高的發(fā)病率和死亡率，也是造成兒童智能低下、腦癱等神經(jīng)系統(tǒng)殘疾的重要原因之一。HIBD的發(fā)病原因及發(fā)病機制較為復雜，越來越多的證據(jù)表明，細胞凋亡(Apoptosis)也參與HIBD，并在其中發(fā)揮獨特的作用。神經(jīng)元細胞凋亡的發(fā)生與患兒的預后有著密切的

2、聯(lián)系。 本實驗通過建立新生兔缺氧缺血性腦損傷模型，對損傷后不同時間點各組動物患側腦組織進行病理組織學光鏡、電鏡動態(tài)觀察，利用TUNEL染色和免疫組織化學手段觀察腦組織中凋亡細胞及其調控蛋白的動態(tài)表達規(guī)律，并應用Tc-HYNIC-Annexin Ⅴ進行活體放射性核素凋亡顯像，探討新生兔缺氧缺血性腦損傷神經(jīng)元凋亡的形態(tài)學動態(tài)變化、凋亡調控蛋白動態(tài)表達規(guī)律及其活體核素凋亡顯像的可行性，為新生兒缺氧缺血性腦損傷神經(jīng)元凋亡的基礎與影像學研

3、究提供動物實驗依據(jù)。 一、實驗動物 新生8～10天健康日本大耳白兔，雌雄不限，體重100～120g，由中國醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院實驗動物部提供。 二、實驗試劑 5％鹽酸利多卡因，2O％烏拉坦(氨基甲酸乙酯)，乙醚，醫(yī)用純氧氣和純氮氣，4％多聚甲醛溶液，0.1M磷酸緩沖液，過氧化氫，不同濃度酒精，二甲苯，中性樹膠。TTC(紅四氮唑)，2.5％戊二醛，1％鋨酸，Epon812(環(huán)氧樹脂)(論文一)；兔抗兔Bcl

4、-2和Bax多克隆抗體(一抗)、SABC試劑盒、TUNEL試劑盒和DAB染色液(論文二)；<'99m>TcO<,4><'->，Annenxin V，Sn<'2+>-Fricine Kit和HYNIC(聯(lián)肼尼克酰胺)-Annexin V Kit(論文三)。 三、實驗儀器 缺氧箱，石蠟切片機，電子天平(ER-185A)，Olympus光學顯微鏡，JEM-1200EX電鏡，CY-100數(shù)字測氧儀，GE Infinia <'VC

5、> Hawkeye雙探頭SPECT/CT，Philip 3.0 T磁共振。 實驗方法: 論文一：按上述方法制備新生兔缺氧缺血性腦損傷模型，將實驗動物按缺氧缺血后不同時間點分成6組：(1)假手術對照組n=7；(2)HIBD 1h組n=5；(3)HIBD 4h組：n=5；(4)HIBD 12h組n=5；(5)HIBD 24h組n=5；(6)HIBD 48h組n=7。觀察各組實驗動物處理過程中的行為變化情況；到達規(guī)定時間后，各

6、組動物經(jīng)4％多聚甲醛心臟灌流后斷頭取腦，取腦時觀察腦組織大體標本情況；取假手術組和HIBD 48h組動物各2只斷頭取腦行TTC染色，觀察有無肉眼可見的梗死灶；每組3只動物腦組織標本常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，冠狀切片、片厚5μm，制作HE染色切片，觀察右側腦組織光鏡病理學變化；每組2只動物取右側大腦皮質、海馬和小腦皮質，腦組織標本經(jīng)2.5％戊二醛固定、1％鋨酸固定、酒精梯度脫水、Epon812包埋、超薄切片，透視電鏡下攝片，觀察腦組織超微

7、結構變化。 論文二：制備新生兔缺氧缺血性腦損傷模型，將實驗動物分成6組：(1)假手術對照組n=5；(2)HIBD 1h組n=5；(3)HIBD 4h組n=5；(4)HIBD 12h組n=5；(5)HIBD 24h組n=5；(6)HIBD 48h組n=5。各組動物經(jīng)4％多聚甲醛心臟灌流后斷頭取腦，常規(guī)脫水、透明和石蠟包埋。各組取右側丘腦中1/3平面、小腦位置行冠狀切片，切片厚度為5pm，進行TUNEL、Bcl-2和Bax蛋白免疫組

8、化檢測，光鏡下觀察凋亡細胞、Bcl-2和Bax蛋白在各部位動態(tài)分布。 論文三：制備新生兔缺氧缺血性腦損傷模型，將實驗動物分成6組：(1)假手術對照組n=5；(2)HIBD 1h組n=5；(3)HIBD 4h組n=5；(4)HIBD 12h組n=5；(5)HIBD 24h組n=5；(6)HIBD48h組n=5。制備<'99m>Tc-HYNIC-Annexin V，各組實驗動物注射顯像劑后1h進行SPECT平面活體凋亡顯像；HIBD

9、 48h組動物還分別在注藥后5min、30min、60min和120min顯像；取HIBD 48h組兩只動物，在活體顯像之后，斷頭取腦進行裸腦離體顯像。 實驗結果: 論文一：實驗組動物缺血缺氧處理后5 min出現(xiàn)煩躁不安，20 min時出現(xiàn)呼吸加深加快，鼻翼煽動，40 min至90 min時出現(xiàn)嗜睡，爬行時左后肢呈拖步，90min至2.5 h時嗜睡明顯，部分動物出現(xiàn)短暫性抽搐；假手術組動物活動狀態(tài)無明顯改變。假手術對照組

10、、HIBD 1h組、HIBD 4h組兩側大小腦半球未見明顯異常改變，HIBD 12h組可見右側大小腦半球與對側相比，顏色蒼白，呈輕度腫脹，軟腦膜下見輕度出血改變，HIBD 24h組和HIBD 48h組見右側大小腦半球腫脹明顯，顏色較蒼白，軟腦膜下出血征象明顯，而對側大小腦半球未見明顯異常。電鏡超微結構形態(tài)學觀察：小腦皮質最先在HIBD 1h出現(xiàn)凋亡征象，其次為大腦皮質在HIBD 12h、海馬CA1區(qū)在HIBD 24h出現(xiàn)凋亡細胞超微結構

11、明顯改變，隨損傷時程進展各部位細胞超微結構改變明顯，細胞器損傷加重。 論文二：TUNEL法檢測HIBD后不同時間點凋亡細胞的動態(tài)變化，光鏡下分別觀察并計數(shù)各組TUNEL法染色切片，標記陽性細胞的細胞核著棕黃色，胞漿不著色。假手術對照組大腦皮質、海馬區(qū)和小腦皮質未見明顯TUNEL標記陽性細胞表達；患側大腦皮質在HIBD 12h TUNEL標記陽性細胞表達明顯；患側海馬CA1區(qū)在HIBD 24h TUNEL標記陽性細胞表達明顯；患側

12、小腦皮質在HIBD 4hTUNEL標記陽性細胞表達明顯。缺氧缺血后時間隨時間推移陽性標記細胞逐漸增多，至HIBD 48 h各部位陽性標記細胞數(shù)達到最多。 (一)免疫組織化學檢測Bcl-2蛋白表達情況假手術對照組患側大腦皮質、海馬區(qū)和小腦皮質未見明顯Bcl-2蛋白表達；患側大腦皮質在HIBD 4h Bcl-2蛋白表達明顯(陽性表達細胞計數(shù)為88.4±1.9)，于HIBD 48h表達明顯減少；患側海馬CA1區(qū)在HIBD 4h Bcl

13、-2蛋白表達明顯(陽性表達細胞計數(shù)為73.6±3.2)，于HIBD 48h表達明顯減少；患側小腦皮質在HIBD 1h Bcl-2蛋白表達明顯(陽性表達細胞計數(shù)為93.6±5.08)，于HIBD 48h表達明顯減少，P均<0.05。 (二)免疫組織化學檢測Bax蛋白表達情況假手術對照組患側大腦皮質、海馬區(qū)和小腦皮質未見明顯Bax蛋白表達；患側大腦皮質Bax蛋白在HIBD 1h表達較少，在HIBD 12h表達明顯增多(陽性表達細胞計

14、數(shù)為65.6±14.3)；患側海馬CA1區(qū)Bax蛋白表達在HIBD 1h表達較少，在HIBD 24h表達明顯增多(陽性表達細胞計數(shù)為76.4±12.0)；患側小腦皮質Bax蛋白在HIBD 1h表達較少，在HIBD 4h表達明顯增多(陽性表達細胞計數(shù)為53±6.7)；缺氧缺血后隨時間推移，HIBD 48h時各部位陽性標記細胞數(shù)達到最多，P均<0.05。 論文三：假手術組動物<'99m>Tc-HYNIC-Annexin V 活體凋亡

15、顯像未發(fā)現(xiàn)兩側大腦區(qū)域有異常放射性濃聚，HIBD 4h組動物顯像發(fā)現(xiàn)右側大腦(患側)局限性放射性輕度濃聚，而對側呈放射性本底影；HIBD 48h組右側大腦見明顯放射性異常濃聚，對側未見異常放射性分布；HIBD 48h組裸腦離體核素凋亡顯像僅見右側大腦放射性濃聚明顯，左側大腦呈放射性空白分布。 結論: 論文一： 1．對新生兔結扎一側頸總動脈，給予低氧處理后，可制作成患側缺氧缺血性腦損傷模型； 2．本研究動物

16、模型屬于輕度腦缺氧血性腦損傷模型，觀察處理后48h尚未造成患側大腦明顯梗死； 3．病理學動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)患側小腦皮質對缺氧缺血較為明顯，其次為大腦皮質和海馬區(qū)，上述區(qū)域存在凋亡細胞，隨損傷后時間推移而明顯。 4．電鏡超微結構動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)患側小腦皮質在損傷因素后較早出現(xiàn)細胞凋亡超微結構改變，其次為大腦皮質和海馬，電鏡可清晰顯示各部位損傷后細胞核和細胞器的形態(tài)學改變。 論文二： 1．在新生兔HIBD模型中，患側小

17、腦細胞凋亡較早發(fā)生，其次為大腦和海馬，缺氧缺血后時間隨時間推移凋亡細胞數(shù)明顯增多。 2．在新生兔HIBD模型中，患側大腦皮質、海馬、小腦皮質在HIBD損傷早期Bcl-2蛋白表達明顯，但于HIBD 48h表達明顯減少，而Bax蛋白表達明顯增多，其中小腦Bax蛋白表達明顯較早出現(xiàn)，其次為大腦和海馬。 論文三： 1．核素凋亡顯像劑<'99m>Tc-HYNIC-Annexin V在新生兔HIBD損傷后4h即可出現(xiàn)患側放射