SCH58261對胎兔缺氧缺血性腦損傷后線粒體功能和細胞凋亡的影響.pdf

1、目的:
　　新生兒缺氧缺血性腦損傷仍然是新生兒死亡和存活后留有永久性神經(jīng)系統(tǒng)缺陷的主要原因，其發(fā)病機制還未完全闡明，目前仍缺乏有效的治療措施。深入研究缺氧缺血性腦損傷的發(fā)病機制，建立有效的防治措施是圍產(chǎn)醫(yī)學界正面臨的重要課題。本文將研究腺苷A2A受體(A2A adenosine receptor，A2AR)拮抗劑SCH58261多次給藥對近足月胎兔持續(xù)宮內(nèi)缺氧缺血性腦損傷后線粒體能量代謝和細胞凋亡的影響，以評估多次給予SCH582

2、61是否具有神經(jīng)保護作用。
　　方法:
　　1.模型制作
　　(1)分組:選擇孕29天健康新西蘭孕兔共16只，隨機分為假手術(shù)組(Sham組，n=3只)、缺氧缺血組（HI組，n=5只）、缺氧缺血+藥物溶劑組(Vehicle組，n=4只)和缺氧缺血+給藥組（SCH58261組，n=4只）。
　　(2)子宮動脈阻斷:胎兔孕29天時在全身麻醉聯(lián)合腰麻下，將4F Fogarty動脈取栓導(dǎo)管插入孕兔左側(cè)股動脈10cm，注入生

3、理鹽水0.3ml擴張球囊，暫時性阻斷子宮血供27min; Sham組插管后不注入生理鹽水擴張球囊。
　　(3)給藥途徑和方法:SCH58261組分別于阻斷后即刻、6h和18h通過孕兔耳緣靜脈注射SCH582612.5ml（首劑0.04mg/kg，后續(xù)追加劑量均為0.02mg/kg，溶于10％DMSO）;Vehicle組在阻斷后即刻、6h和18h分別注射藥物溶劑，即10％ DMSO2.5ml，Sham組和HI組不給藥。
　　2

4、.模型評估
　　(1)時間:各組均在術(shù)后24小時（孕30天）行剖宮產(chǎn)，將存活新生兔放入已提前預(yù)熱至35℃的嬰兒暖箱內(nèi)保暖。
　　(2)記錄內(nèi)容:記錄新生兔一般情況如單窩產(chǎn)崽數(shù)、死胎率及出生體重等。剖宮產(chǎn)術(shù)后1h后采用神經(jīng)行為學評分量表評估存活新生兔神經(jīng)行為學改變。
　　3.指標檢測
　　(1)H&E染色法觀察腦組織不同部位結(jié)構(gòu)及細胞形態(tài);
　　(2) TUNEL染色法（原位缺口末端標記法）觀察腦組織不同部位

5、細胞核DNA斷裂情況;
　　(3)免疫組化法觀察腦組織不同部位Cleaved Caspase-3蛋白表達情況;
　　(4)制備透射電鏡標本，觀察新生兔腦組織不同區(qū)域錐體細胞內(nèi)線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)變化;
　　(5)采用比色法檢測新生兔腦皮層ATP合成能力;
　　(6)采用Real-Time PCR法檢測新生兔腦組織不同部位的Caspase-3 mRNA表達情況。
　　4.數(shù)據(jù)統(tǒng)計和圖表制作
　　采用SPSS1

6、6.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料符合正態(tài)分布用均數(shù)±標準差((x)±s)表示，否則用中位數(shù)±四分位數(shù)表示。多個樣本間均數(shù)的比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，神經(jīng)行為學評分中的等級資料（除翻正反射得分）采用Kruskal-Wallis秩和檢驗，組間比較用LSD法。秩和檢驗若有統(tǒng)計學意義，予混合排秩，也采用LSD法進行兩兩比較。多個樣本間二分類變量率的比較用x2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。運用Im

7、age-Pro Plus軟件進行細胞計數(shù);GraphPad Prism5.0制做數(shù)據(jù)圖表;Photoshop7.0進行圖片編輯。
　　結(jié)果:
　　1.新生兔一般情況
　　Sham組、HI組、Vehicle組和SCH58261組存活新生兔分別為21只、37只、31只和29只，死胎率分別是0％、10.8％、12.9％、10.3％。HI組和Vehicle組死胎率明顯增加，SCH58261組死胎率與HI組和Vehicle組比較

8、差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　2.新生兔神經(jīng)行為學評估
　　HI組和Vehicle組在肌張力、姿勢、運動能力、翻正反射成功次數(shù)、翻正反射得分、吮吸及吞咽協(xié)調(diào)能力和嗅覺刺激等項目評分上出現(xiàn)明顯異常，SCH58261組與Vehicle組和H工組比較，上述評分均無顯著改善，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　3.H&E染色法觀察腦組織結(jié)構(gòu)變化
　　(1)額頂部皮層H&E染色結(jié)果顯示，Vehicle組椎體細

9、胞層出現(xiàn)細胞排列紊亂，部分椎體細胞形態(tài)異常，同時出現(xiàn)軸突走向模糊;SCH58261組椎體細胞層細胞排列及形態(tài)基本同Vehicle組。
　　(2)紋狀體豆狀核H&E染色結(jié)果顯示，Vehicle組出現(xiàn)細胞分布不均，部分細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞核腫脹，并可見凋亡細胞;SCH58261組細胞分布及形態(tài)基本同Vehicle組，未見明顯改善。
　　(3)海馬H&E染色結(jié)果顯示，Vehicle組CA1區(qū)和CA3區(qū)細胞排列和分布未見明顯異常，未

10、見凋亡細胞，但細胞核腫脹明顯。SCH58261組細胞排列及形態(tài)結(jié)構(gòu)基本同Vehicle組，未見明顯改善。
　　4.TUNEL標記法原位觀察各腦區(qū)細胞DNA斷裂情況
　　TUNEL加DAPI復(fù)染結(jié)果顯示，皮層和海馬均未見陽性細胞。而在紋狀體豆狀核部位，Sham組偶見數(shù)個綠色熒光;HI組和Vehicle組可見較多散在分布的綠色熒光;SCH58261組TUNEL陽性率較HI組和Vehicle組均顯著性降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0

11、.05)。
　　5.免疫組化法觀察Cleaved Caspase-3表達情況
　　(1)額項部皮層免疫組化結(jié)果顯示，各實驗組大腦額頂部皮層CleavedCaspase-3陽性率較低，HI組、Vehicle組和SCH58261組Cleaved Caspase-3陽性率[中位數(shù)(四分位數(shù)間距）]分別為2.0％(1.7％，3.4％)，1.7％(1.4％，1.8％)，0.6％(0.3％，1.2％)，SCH58261組陽性率較前兩組明

12、顯下降，且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　(2)紋狀體豆狀核免疫組化結(jié)果顯示，HI組、Vehicle組和SCH58261組Cleaved Caspase-3陽性率[中位數(shù)(四分位數(shù)間距）]分別為4.5％(0.7％，5.7％)，4.3％(4.0％，6.2％)，1.6％(0.6％，5.5％)，SCH58261組陽性率較前兩組明顯下降，但組內(nèi)變異大，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　(3)海馬免疫組化結(jié)果顯示，HI組

13、、Vehicle組和SCH58261組海馬CA1區(qū)Cleaved Caspase-3陽性率[中位數(shù)（四分位數(shù)間距）]分別為26.9％(21.7％，47.1％)，29.6％(19.6％，44.0％)，8.9％(3.8％，9.4％)，SCH58261組陽性率較前兩組明顯下降，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。HI組、Vehicle組和SCH58261組海馬CA3區(qū)Cleaved Caspase-3陽性率[中位數(shù)四分位數(shù)間距]分別為40.9

14、％(30.1％,76.2％),51.5％(26.1％,71.1％),13.4％(6.2％,25.0％), SCH58261組陽性率較前兩組明顯下降，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　6.電鏡觀察各組大腦皮層、紋狀體和海馬錐體細胞發(fā)現(xiàn)，HI組和Vehicle組椎體細胞均出現(xiàn)明顯腫脹，呈毒性水腫表現(xiàn)，并可見核膜斷裂，伴線粒體分布不均、形態(tài)異常;SCH58261組細胞水腫無明顯改善，但線粒體形態(tài)明顯改善。
　　7.比色法測

15、定腦皮層ATP合成能力結(jié)果顯示，Vehicle組與HI組ATP水平較Sham組均顯著下降（P＜0.05）;SCH58261組ATP水平較HI組和Vehicle組無顯著性改善(P＞0.05)。
　　8.Real-Time PCR結(jié)果顯示，SCH58261組皮層、紋狀體、海馬Caspase-3mRNA相對表達量與HI組和Vehicle組比較均無顯著性差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.近足月胎兔持續(xù)宮內(nèi)缺氧缺血性腦