胸膜間皮細(xì)胞上皮鈉通道的表達(dá)及調(diào)控.pdf

1、間皮細(xì)胞是一種分布在漿膜腔的特殊類型上皮細(xì)胞，被覆于胸膜腔，心包腔，腹膜腔以及內(nèi)臟器官表面。直到最近的二十年人們才注意到間皮細(xì)胞在維持漿膜腔完整性及功能方面發(fā)揮重要作用。胸腔積液是臨床常見疾病，由于胸膜腔內(nèi)液體的分泌和重吸收之間的平衡紊亂所致。越來越多的證據(jù)表明間皮細(xì)胞能主動轉(zhuǎn)運水和電解質(zhì)，繼而調(diào)節(jié)體腔內(nèi)的液體總量。 上皮鈉通道(ENaC)是鈉離子通過極化上皮細(xì)胞頂側(cè)膜的主要通路，目前已被克隆和進(jìn)行特征研究。至今已克隆出五種EN

2、aC亞單位，分別命名為α—，β—，γ—，δ—和ε—ENaC。ENaC通道依其組成亞單位的不同，表現(xiàn)的生物物理學(xué)特性也不盡相同。當(dāng)利尿劑阿米洛利加入頂膜側(cè)的浴液內(nèi)時，10-6M的濃度即能抑制Na+的轉(zhuǎn)運。 間接證據(jù)表明在人類和綿羊壁層腹膜存在阿米洛利敏感性鈉通道。應(yīng)用阿米洛利后跨間皮的電阻增加，表明可能存在阿米洛利敏感性離子轉(zhuǎn)運途徑，其可能參與腹膜透析期間的超濾過程和鈉的清除。通過對比上皮細(xì)胞的極化狀態(tài)，可以推測ENaC通道蛋白表

3、達(dá)在腹膜腔的漿膜側(cè)。已有證據(jù)表明存在于肺上皮細(xì)胞中的ENaC在肺泡液體清除率方面發(fā)揮重要作用，而有關(guān)間皮組織中的胸膜腔液體清除的機制目前尚不清楚。我們推測在人間皮細(xì)胞中有ENaC的表達(dá)，并成為阿米洛利敏感性跨間皮電阻的分子學(xué)基礎(chǔ)。 在本研究中，我們檢測了ENaC在人和小鼠間皮細(xì)胞中的表達(dá)。我們的研究結(jié)果首次表明了ENaC通道在人胸膜間皮細(xì)胞中有生化方面及功能性的表達(dá)，并能被細(xì)胞cAMP和cGMP上調(diào)?？梢杂纱送茰yENaC在調(diào)控胸

4、膜腔液體轉(zhuǎn)運方面發(fā)揮重要作用，并參與胸腔積液的病理生理過程。 方法： 細(xì)胞培養(yǎng)—NCI—H441細(xì)胞購自American Type Culture Collection(ATCC)。人胸膜間皮瘤M9K細(xì)胞系和人原代胸膜間皮細(xì)胞由Dr． Steven Idell提供(美國德州大學(xué)健康科學(xué)中心)。人胸膜間皮細(xì)胞提取于患有充血性心力衰竭病人的胸腔積液。H441和人原代胸膜間皮細(xì)胞用添加10％胎牛血清和抗生素的RPMI培養(yǎng)液(A

5、TCC)進(jìn)行培養(yǎng)，M9K細(xì)胞則生長于Medium199(Invitrogen)中。 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)—將長滿的M9K及人原代胸膜間皮細(xì)胞刮于冷的PBS液中，離心后置于—80℃保存。BALB/c雄性小鼠(Jackson Laboratory)充分麻醉后手術(shù)分離小鼠壁層胸膜組織。用TRIzol試劑盒(Invitrogen)根據(jù)使用手冊提取總RNA。采用一步法RT-PCR試劑盒(Qiagen)在梯度熱循環(huán)儀(Eppe

6、ndorf Scientific)中進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物用DNA序列分析證實(DNA Sequencing Core，UAB)。 Western blot—應(yīng)用6％凝膠進(jìn)行SDS-PAGE分離后，將蛋白轉(zhuǎn)染于PVDF膜上(Bio—Rad)。在含20mM Tris—C1 pH7.5，0.5M NaCl，5％無脂肪凍干奶粉溶液中孵育1小時后，加入一抗，4℃過夜。二抗室溫孵育30分鐘。應(yīng)用ECL試劑盒(Amersham)

7、分析圖像，所用ENaC亞單位抗體的稀釋濃度為1：5000。 免疫熒光和共聚焦顯微鏡檢查，種于濾膜或玻片的細(xì)胞用3％福爾馬林(EM Sciences)固定45分鐘，繼以0.5％ Triton X—100孵育3分鐘。用α—，β—，γ—和δ—ENaC的多克隆抗體20μg/mL常溫下孵育細(xì)胞2小時，然后用Alexa Fluor488羊抗兔IgG(H+L)10μg/mL(Invitrogen)常溫孵育細(xì)胞2小時，采用300 nM DAPI

8、(Invitrogen)進(jìn)行核染5分鐘。應(yīng)用連有Olympus S97809相機的Olympus BX50熒光顯微鏡獲取圖像。用共聚焦顯微鏡采集側(cè)視圖像。在Adobe PhotoShop CS3 extended中進(jìn)行融合圖像分析。 尤斯灌流室，切除的胸膜組織置于尤斯灌流室(Physiologic Instruments)之前保存在生理鹽溶液中?？玳g皮短路電流由充以3 M KC1，4％瓊脂糖鹽橋的Ag—AgCl電極進(jìn)行測定。用V

9、CC—MC8電壓鉗放大器(Physiologic Instruments)測定短路電流，用Acquire and Analyse軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析(version2.3，Physiologic Instruments)。 爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)及雙電極電壓鉗記錄—成年雌性非洲爪蟾(Xenopus Express)充分麻醉后手術(shù)取出蛙卵，按1α：1β：1γ：1δ比例細(xì)胞內(nèi)注射以50 nl無Rnase水溶解的hENaC cRNAs25 ng

10、，注射cRNA48小時后應(yīng)用雙電極電壓鉗技術(shù)記錄全細(xì)胞電流。應(yīng)用TEV—200電壓鉗放大器(Dagan)進(jìn)行爪蟾卵母細(xì)胞電壓鉗制和記錄電流，采用pCLAMP10.0軟件(Molecular Devices)進(jìn)行采樣和數(shù)據(jù)分析。 膜片鉗技術(shù)—將載有M9K細(xì)胞的玻片從培養(yǎng)皿中移出，放在置于倒置熒光顯微鏡(Leica DM IRB)的浴槽內(nèi)。應(yīng)用Axopatch200B放大器(Molecular Devices)進(jìn)行系列阻抗和電容補償

11、。記錄全細(xì)胞電流時保持電位—40mV，應(yīng)用—100至+100mV，步階10 mV的電位進(jìn)行電流電壓曲線分析。單通道電流記錄采用細(xì)胞貼附模式。采樣頻率為1—2 kHz，濾波頻率為0.3 kHz。 數(shù)據(jù)分析—所有數(shù)據(jù)結(jié)果采用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用單尾分析法應(yīng)用Origin8.0軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行分析，P<0.05被認(rèn)為統(tǒng)計學(xué)差異顯著。 結(jié)果： RT-PCR結(jié)果顯示四種(α，β，γ和兩種δ)ENaC亞單位在人原代胸膜

12、間皮細(xì)胞，人間皮瘤細(xì)胞系(M9K)，和小鼠胸膜組織中有表達(dá)。另外，Western blot和免疫熒光檢查結(jié)果證實了α，β，γ和δENaC亞單位在人原代胸膜間皮細(xì)胞和M9K細(xì)胞中的蛋白水平表達(dá)。通過尤斯灌流室裝置在M9K單層細(xì)胞和小鼠胸膜組織中記錄到了一種能被阿米洛利抑制的短路電流。全細(xì)胞膜片鉗記錄結(jié)果顯示在M9K細(xì)胞中的ENaC樣通道，阿米洛利的IC50值為21μM。這種陽離子通道對細(xì)胞外Na+有很高的親和力(Km值為53mM)，其離子

13、選擇性與ENaC相同，均為Li+>Na+>K+。Li+的單通道電導(dǎo)值為15 pS。四種ENaC亞單位在爪蟾卵母細(xì)胞中共同表達(dá)時能形成一種功能性的Na+通道。另外，我們發(fā)現(xiàn)在小鼠胸膜組織中forskolin和細(xì)胞膜通透性的cGMP均能增加短路電流。 結(jié)論： 研究結(jié)果證實了在M9K細(xì)胞，一種人胸膜間皮瘤細(xì)胞系，和小鼠胸膜組織中α—，β—，γ—，和δ—ENaC亞單位的mRNA及蛋白水平表達(dá)。利用尤斯灌流系統(tǒng)我們在小鼠胸膜組織和