醛固酮快速調(diào)控腎上皮細(xì)胞鈉通道作用的研究.pdf

1、研究目的:醛固酮在調(diào)節(jié)細(xì)胞外液,維持電解質(zhì)平衡以及控制血壓穩(wěn)定的過程中發(fā)揮著重要的作用,醛固酮重要的生理功能有賴于通過調(diào)控腎上皮鈉通道(ENaC)對鈉的重吸收,目前已知相關(guān)的作用機制分為基因組作用和非基因組作用。其中,研究較清楚的是醛固酮的基因組作用方式:醛固酮進(jìn)入集合管主細(xì)胞后,與胞漿內(nèi)的鹽皮質(zhì)激素受體(mineralocorticoid receptor,MR)結(jié)合,形成激素-受體復(fù)合體,后者進(jìn)入細(xì)胞核與核中DNA特異性結(jié)合位點相互

2、作用,調(diào)節(jié)特異性mRNA轉(zhuǎn)錄,最終合成多種醛固酮誘導(dǎo)蛋白(aldosterone-induced protein,AIP),使管腔膜(apical side)ENaC活性增強,基側(cè)膜(basolateral side)鈉鉀泵的活性增加,從而促進(jìn)跨上皮細(xì)胞的Na+重吸收。醛固酮基因組作用的特點是作用起效較慢,作用時間長,對MR阻斷劑敏感。此外,醛固酮還可發(fā)揮快速的非基因組作用來調(diào)控Na+的重吸收,此作用的特點為起效迅速,對MR阻斷劑不敏感

3、,但其內(nèi)在機制還知之甚少。因此研究醛固酮非依賴MR快速調(diào)控ENaC的作用及其相關(guān)的作用機制,有助于進(jìn)一步全面了解醛固酮調(diào)節(jié)ENaC作用的生理、病理意義,同時也可促進(jìn)新型醛固酮拮抗藥物的研發(fā),為醛固酮快速作用提供可能的應(yīng)對措施。
　　主要內(nèi)容:
　　1、建立具有ENaC活性的哺乳動物腎上皮細(xì)胞模型并進(jìn)行評價。
　　2、研究醛固酮快速調(diào)控ENaC的作用。
　　3、探討醛固酮快速調(diào)控ENaC的可能機制。
　　研究

4、方法:
　　1.實驗細(xì)胞模型的建立
　　建立具有ENaC活性的哺乳動物腎上皮細(xì)胞模型-選擇MDCK(Madin-Darby canine kidney)、mpkCCD(mouse principle cell of kidney in cortical collecting duct)兩種細(xì)胞株,培養(yǎng)成具有完整膜,有極性,高阻抗,阿米洛利敏感的細(xì)胞模型,最后通過觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、測量跨膜電阻值、測量細(xì)胞單通道記錄三個方面來評

5、估,擇優(yōu)選出適合進(jìn)一步實驗的理想細(xì)胞模型。
　　2.醛固酮對ENaC的快速調(diào)控作用
　　給予醛固酮(10-6M/L)作用于mpkCCD細(xì)胞模型,觀察醛固酮對細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、阿米洛利敏感的跨膜電阻、胞內(nèi)鈣離子濃度、單通道離子電流的影響。使用MR阻斷劑螺內(nèi)酯以及醛固酮轉(zhuǎn)錄、蛋白合成抑制劑,驗證醛固酮對ENaC快速(<3小時)調(diào)節(jié)作用主要是非依賴MR的非基因組作用。
　　3.醛固酮對ENaC作用機制的研究
　　(1)通過

6、使用PI3-K通路特異性的阻斷劑LY294002(50um/L)驗證PI3-K通路在醛固酮快速調(diào)控ENaC過程中的作用。
　　(2)通過使用鈣離子載體A23187(1um/L)快速增加胞內(nèi)鈣離子濃度來探討胞內(nèi)鈣離子在醛固酮調(diào)控快速調(diào)控ENaC過程中的作用。
　　(3)通過使用細(xì)胞松弛素D(CytD)打斷細(xì)胞骨架F-actin,探討細(xì)胞形態(tài)與ENaC功能活性之間的關(guān)系。
　　4.主要的指標(biāo)及測量方法
　　(1)細(xì)胞

7、形態(tài)學(xué)觀察:掃描離子電導(dǎo)顯微鏡(SICM)
　　(2)跨膜電阻值:跨膜電阻儀(EVOM2)
　　(3)單通道離子電流:膜片鉗cell-attached單通道記錄
　　(4)胞內(nèi)鈣離子:高速比率鈣離子濃度測量熒光顯微技術(shù)
　　結(jié)果:
　　1.建立了具有ENaC活性哺乳動物腎上皮細(xì)胞模型-mpkCCD細(xì)胞模型。
　　2.醛固酮作用于mpkCCD細(xì)胞,細(xì)胞發(fā)生橫向收縮縱向伸展,胞內(nèi)鈣離子濃度升高,整體膜和單

8、通道水平的ENaC活性增強,表現(xiàn)為阿米洛利敏感的跨膜電阻升高和離子通道開放概率增加。
　　3.LY294002能夠阻斷醛固酮對ENaC的激活作用,表現(xiàn)為細(xì)胞恢復(fù)原貌,阿米洛利敏感的跨膜電阻降低和離子通道開放概率減少。
　　4.A23187能迅速增加胞內(nèi)鈣離子濃度,并增強ENaC活性,表現(xiàn)在阿米洛利敏感的跨膜電阻升高和離子通道開放概率增加。
　　5.CytD能使細(xì)胞發(fā)生橫向收縮縱向伸展的形變,ENaC活性增強,表現(xiàn)為阿米