核因子κB信號途徑調(diào)控腹膜間皮細(xì)胞表達(dá)MCP-1的實驗研究.pdf

1、腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)是終末期腎臟病的主要替代療法，具有血液透析(hemodialysis，HD)無法替代的優(yōu)勢。然而長期的腹膜透析幾乎不可避免地引起腹膜炎性改變和腹膜纖維化，二者病理改變主要表現(xiàn)為腹膜層單核巨噬細(xì)胞浸潤和腹膜細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，最終導(dǎo)致腹膜透析失敗。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是大腸桿菌的主要致病物質(zhì)，是其唯一內(nèi)毒素。LPS主要來源于長期腹膜透析引起的導(dǎo)管相關(guān)性

2、感染，其次腸道內(nèi)細(xì)菌可穿過通透性增高的腸壁進(jìn)入腹腔。LPS和腹膜透析液中的高濃度葡萄糖是引起腹膜炎性改變和腹膜纖維化的主要原因。 腹膜間皮細(xì)胞(peritoneal mesothelial cells，PMC)是腹膜表面的一層細(xì)胞，是腹膜透析時與腹膜透析液直接接觸的第一道生理屏障，也是腹膜損傷反應(yīng)的第一步。研究腹膜間皮細(xì)胞在LPS作用下的反應(yīng)是研究腹膜損傷機(jī)制和干預(yù)腹膜損傷的基礎(chǔ)。 單核細(xì)胞趨化蛋白1(motocyte

3、chemoattractant protein-1，MCP-1)是重要的趨化因子CC亞家族的一員。MCP-1的受體CCR2是一類表達(dá)于不同類型細(xì)胞(單核細(xì)胞、記憶性T淋巴細(xì)胞、嗜堿性白細(xì)胞等)上的含有7個跨膜區(qū)的G蛋白偶聯(lián)受體。MCP-1與CCR2結(jié)合后，CCR2變構(gòu)并與G蛋白結(jié)合，激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮生物學(xué)作用。MCP-1主要趨化單核/巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)粘附分子，使各種炎性細(xì)胞尤其是單核/巨噬細(xì)胞向病變

4、部位聚集，啟動炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，進(jìn)一步導(dǎo)致組織器官纖維化、硬化。目前認(rèn)為其在糖尿病腎病和腹膜透析腹膜炎性病變和腹膜纖維化中起到了啟動和加重病變的作用。目前國內(nèi)外還沒有關(guān)于LPS影響PMC表達(dá)MCP-1的系統(tǒng)研究，因此本實驗確立其為本研究課題之一。核因子kappaB(nuclear factor-kappaB，NF-kB)是重要的參與炎癥反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，存在于多種組織細(xì)胞中，與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。NF-kB是調(diào)節(jié)多種

5、因子轉(zhuǎn)錄的核因子，正常情況下在細(xì)胞漿中以二聚體形式與無活性的調(diào)節(jié)亞單位NF-kB抑制蛋白(inhibitory protein ofNF-kB，IkB)形成復(fù)合物，遮蔽其核定位序列。在外界多種因素刺激下，IkB在被激活的．IkB激酶(IkB kinase，IKK)復(fù)合物的作用下發(fā)生磷酸化，磷酸化后的IkB被泛素識別而發(fā)生泛素化，最后被26S蛋白酶體所降解，IkB的降解使NF-kB的核定位序列暴露出來，NF-kB進(jìn)入核內(nèi)與相關(guān)基因啟動子區(qū)

6、kB序列結(jié)合，從而參與相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。目前研究較多并被證明有激活轉(zhuǎn)錄活性的NF-kB是p65：p50二聚體，因此通常所指的NF-kB是p65：p50，參與此二聚體激活過程的主要成分有IKKβ、IkBα等?；蛐蛄械臋z索和相關(guān)研究表明MCP-1的基因啟動子區(qū)有NF-kB結(jié)合序列，NF-kB信號途徑參與了某些組織細(xì)胞MCP-1的表達(dá)。在腹膜間皮細(xì)胞中NF-kB的表達(dá)情況是研究其是否參與了MCP-1表達(dá)過程的基礎(chǔ)。 NF-kB核移位抑

7、制肽SN50、蛋白酶體抑制劑MG-132、IkBα磷酸化抑制劑BAY11-7082、IKKβ特異性抑制劑SC-514是NF-kB途徑不同位點抑制劑，檢測PMC在這些抑制劑作用下MCP-1的表達(dá)情況，可以明確NF-kB途徑在LPS促進(jìn)PMC表達(dá)MCP-1中的作用。研究MCP-1在PMC中的表達(dá)情況以及NF-kB途徑在此過程中的作用可為改善腹膜透析失超濾提供思路。 方法 1、組織來源：雄性SD大鼠數(shù)只，體重120±20g，由

8、中國醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。 2、細(xì)胞培養(yǎng)：胰蛋白酶消化法分離培養(yǎng)PMC，倒置相差顯微鏡、透射電鏡、掃描電鏡、免疫細(xì)胞化學(xué)方法對培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 3、在LPS、高糖作用下，用RT-PCR法檢測PMC表達(dá)MCP-14RNA的情況；用Western blot法檢測PMC表達(dá)MCP-1、p-IKKβ、IkBα、p-IkBα及細(xì)胞核內(nèi)p65蛋白的情況。細(xì)胞免疫熒光法檢測p65的核移位情況。 細(xì)胞分組： (1

9、)不同濃度LPS組：0、0.1、1.0、10、100mg/L； (2)1.0mg/L LPS作用不同時間組：0、0.5、1、3、12、24、48h； (3)高糖、LPS聯(lián)合組：正常組、1.5％葡萄糖、1.0mg/L LPS、1.5％葡萄糖+1.0mg/L LPS。 4、在SN50、MG-132、BAY11-7082、SC-514的作用下，用RT-PCR法檢測MCP-1mRNA的表達(dá)情況；用Western blot

10、法檢測PMC表達(dá)MCP-1蛋白的情況。 細(xì)胞分組： (1)不同濃度(10、25、50mg/L)SN50預(yù)孵育3h，加入1.0mg/LLPS再作用3h；設(shè)立SN50M(SN50無活性對照肽)對照組； (2)不同濃度(5、10、20uM)MG-132預(yù)孵育3h，加入1.0mg/LLPS再作用3h； (3)不同濃度(5、10、20uM)BAY11-7082預(yù)孵育3h，加入1.0mg/LLPS再作用3h；

11、 (4)不同濃度(10、50、100uM)SC-514預(yù)孵育1h，加入1.0mg/LLPS再作用3h。 結(jié)果 1、LPS促進(jìn)PMC表達(dá)MCP-10.1mg/L的LPS可促進(jìn)MCP-1mRNA和蛋白的表達(dá)(P<0.05)，100mg/LLPS的作用最強(qiáng)(P<0.01)。1.0mg/L濃度的LPS作用1h時MCP-1mRNA表達(dá)增加(P<0.05)，3h時MCP-1蛋白明顯增高(P<0.05)，48hMCP-1mRNA和蛋白

12、質(zhì)表達(dá)達(dá)到最大(P<0.01)。 2、高糖、LPS對PMC表達(dá)MCP-1的影響高糖促進(jìn)PMC表達(dá)MCP-1(P<0.01)；與單純高糖和單純LPS比，高糖、LPS聯(lián)合作用促進(jìn)PMC表達(dá)MCP-1的作用最強(qiáng)(P<0.05)。 3、LPS對PMC表達(dá)p-IKKβ、IkBα、p-IkBα、p65的影響在0.1mg/L LPS作用下，細(xì)胞漿中p-IKKβ增多(P<0.05)，IkBα減少，p-IkBα增多(P<0.05)，核中p

13、65表達(dá)增加(P<0.05)，100mg/L LPS作用最大(P<0.01)；LPS作用0.5h時細(xì)胞中p-IKKβ增多(P<0.05)，IkBα減少，p-IkBα增多(P<0.05)，核中p65表達(dá)增加(P<0.01)；1h時細(xì)胞中p-IKKβ增至最多(P<0.01)，3h時細(xì)胞中p-IKKβ迅速下降，IkBα減至最低，p-IkBα增至最多(P<0.01)，細(xì)胞核中p65表達(dá)最高(P<0.01)，隨后P-IKKβ緩慢下降，IkBα開始

14、增高，p-IkBα開始減少，核中p65表達(dá)開始下降，24h時p-IKKβ、p-kBα再次增高，IkBα減少，p65在核內(nèi)明顯增多，48h時p-IKKβ、p-kBα顯著下降，IkBα明顯增高，p65在核內(nèi)明顯減少。 4、NFkB信號途徑在LPS促進(jìn)PMC表達(dá)MCP-1中的作用與LPS組比，10mg/L SN50、5uM MG-132、5uM BAY11-7082、10uM SC-514均可抑制LPS作用下MCP-1mRNA和蛋白質(zhì)

15、的表達(dá)(P<0.05)，50mg/L SN50、20uMMG-132、20uM BAY11-7082、100uM SC-514明顯抑制MCP-1mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)(P<0.01)；SN50M則無此作用(P>0.05)。 結(jié)論 1、LPS促進(jìn)PMC表達(dá)MCP-1mRNA和蛋白質(zhì)呈濃度和時間依賴性； 2、高濃度葡萄糖和LPS聯(lián)合作用對PMC表達(dá)MCP-1mRNA和蛋白質(zhì)的作用大于單純葡萄糖或單純LPS；