真核翻譯起始因子(eIF4G1)對(duì)NMD及自噬的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、真核翻譯起始因子eIF4G1是真核生物翻譯起始過程中連接核糖體與mRNA的腳手架蛋白，作為翻譯起始的中心蛋白招募眾多翻譯起始因子參與翻譯過程。eIF4G1參與熱應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和低氧應(yīng)激等細(xì)胞應(yīng)激的調(diào)節(jié)，與增殖、生物能量代謝和線粒體活性密切相關(guān)，并且對(duì)這些過程相關(guān)因子的翻譯具有重要的調(diào)控作用。本研究采用厄爾氏平衡鹽溶液(EBSS)處理Hela細(xì)胞模擬營養(yǎng)饑餓應(yīng)激，探索應(yīng)激狀態(tài)下eIF4G1對(duì)無義介導(dǎo)的mRNA降解(NMD)及自噬的調(diào)控作

2、用。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在營養(yǎng)饑餓狀態(tài)下eIF4G1表達(dá)下調(diào)。此外，eIF4G1的下調(diào)能夠抑制NMD活性，從而上調(diào)NMD內(nèi)源性底物基因;同時(shí)還有助于饑餓應(yīng)激過程中自噬的激活，而激活的自噬又可以進(jìn)一步降解eIF4G1蛋白，這暗示細(xì)胞應(yīng)激過程中存在應(yīng)激增強(qiáng)機(jī)制。這一發(fā)現(xiàn)有助于深入了解細(xì)胞應(yīng)對(duì)外界環(huán)境刺激時(shí)的適應(yīng)性機(jī)制，解析細(xì)胞自噬機(jī)制與NMD機(jī)制之間的交互作用，為細(xì)胞應(yīng)激調(diào)控機(jī)制的研究提供線索。主要研究結(jié)果如下:
　　1.EBSS誘導(dǎo)的營養(yǎng)

3、饑餓應(yīng)激激活自噬、抑制NMD。EBSS處理Hela細(xì)胞后分別檢測(cè)自噬水平和NMD活性，結(jié)果顯示，細(xì)胞自噬被激活而NMD活性被抑制，且二者活性具有負(fù)相關(guān)性。
　　2.雷帕霉素抑制Hela細(xì)胞NMD活性。使用2.5μM雷帕霉素處理細(xì)胞2h后處理組NMD內(nèi)源性底物基因TBL2、GADD45B mRNA水平較對(duì)照組均有顯著性上調(diào)(P＜0.05)，說明自噬特異性激活劑雷帕霉素可以抑制NMD活性。
　　3.營養(yǎng)饑餓應(yīng)激狀態(tài)下eIF4G1

4、表達(dá)下調(diào)。eIF4G1 mRNA水平在EBSS處理2h、4h及6h都有顯著下調(diào)（2h和4h，P＜0.05;6h，P＜0.01），并且其蛋白水平也隨著處理時(shí)間的延長明顯下降。
　　4.干涉eIF4G1能夠抑制NMD活性。干涉eIF4G148h后，NMD內(nèi)源底物基因GADD45B mRNA水平顯著上調(diào)(P＜0.05)，共轉(zhuǎn)染干涉片段和NMD報(bào)告載體結(jié)果顯示干涉組NMD報(bào)告載體底物TPI mRNA水平較NC組顯著上調(diào)(P＜0.01)，說

5、明干涉eIF4G1后NMD活性被抑制。
　　5.干涉eIF4G1能夠激活自噬。干涉eIF4G148h后SQSTM1蛋白水平明顯下降，且LC3BⅡ/LC3BⅠ比值較NC組明顯增大，LC3-EGFP-Hela細(xì)胞EGFP綠色熒光斑點(diǎn)數(shù)量明顯增加，說明細(xì)胞自噬水平增強(qiáng)。
　　6.營養(yǎng)饑餓應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬降解eIF4G1蛋白。免疫熒光結(jié)果顯示EBSS誘導(dǎo)的營養(yǎng)饑餓應(yīng)激狀態(tài)下eIF4G1蛋白與自噬體膜蛋白LC3存在共定位，表明處理后eI

6、F4G1蛋白移位于自噬體;此外，干涉自噬關(guān)鍵基因ATG7阻斷自噬后，在EBSS誘導(dǎo)的營養(yǎng)饑餓應(yīng)激狀態(tài)下干涉組eIF4G1蛋白水平較NC組明顯上升，表明eIF4G1降解通路被阻斷。說明營養(yǎng)饑餓應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬能夠降解eIF4G1。
　　以上結(jié)果表明，細(xì)胞在營養(yǎng)饑餓應(yīng)激過程中下調(diào)eIF4G1的表達(dá)，一方面增強(qiáng)細(xì)胞自噬進(jìn)而增加細(xì)胞物質(zhì)能量的循環(huán)利用來提高細(xì)胞應(yīng)對(duì)環(huán)境刺激的能力;另一方面抑制NMD活性從而上調(diào)相關(guān)抗應(yīng)激因子表達(dá)以緩解細(xì)胞應(yīng)激