人羊膜細胞移植合并褪黑素治療MPTP致PD小鼠模型的實驗研究.pdf

1、帕金森病(PD)是一種中老年人常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，發(fā)病率呈逐年上升趨勢。目前PD的病因尚不明確，但與多種因素有關(guān)，如氧化應(yīng)激、線粒體功能異常、興奮毒作用、細胞凋亡及遺傳因素等，上述多種因素造成了大腦黑質(zhì)-紋狀體多巴胺神經(jīng)元變性而引發(fā)臨床癥狀。目前臨床上PD的治療多采用化學(xué)藥物療法，因療效不理想和副作用較大，尋找新的治療手段和途徑已成為迫切需要。 20世紀(jì)90年代初，神經(jīng)干細胞(NSCs)的發(fā)現(xiàn)是神經(jīng)科學(xué)界的突破性進展，尤

2、其成體NSCs的存在揭開了人類神經(jīng)科學(xué)研究的新篇章。在衰老及其相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病患者的腦內(nèi)，不僅有神經(jīng)元的變性丟失，而且有神經(jīng)發(fā)生的異常，提示神經(jīng)發(fā)生障礙可能參與了神經(jīng)退行性病變過程。因此近年NSCs移植治療和外源因素調(diào)節(jié)內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生的研究成為神經(jīng)科學(xué)的熱點之一。 用于移植的細胞有胚胎NSCs、胚胎干細胞、骨髓干細胞等，但移植細胞的來源大多有限，且有成瘤性、倫理學(xué)等方面的缺點，限制了其臨床應(yīng)用。而人羊膜細胞(HACs)是來源

3、于正常產(chǎn)婦產(chǎn)后的廢棄組織，抗原性低，無倫理學(xué)問題，尤其近年來研究表明，羊膜組織細胞具有神經(jīng)生物學(xué)特點和功能，如存在著神經(jīng)前體細胞等，這些優(yōu)勢使羊膜組織細胞有望成為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的可靠細胞來源。我們通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)手段，觀察羊膜細胞的神經(jīng)生物學(xué)特性。 盡管現(xiàn)有研究已證明移植細胞可以在宿主體內(nèi)生存，但移植的細胞大約90％將會死亡或凋亡，其原因主要是氧化應(yīng)激引起的微環(huán)境不適。褪黑素(MT)是松果體分泌的一種吲哚類神經(jīng)內(nèi)分泌激素，有

4、很強的清除自由基和間接抗氧化作用。同時，MT易于通過血腦屏障和細胞膜等生物膜，具有很強的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的親和性；加之MT作為一種內(nèi)源性的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，有良好的吸收率，并可通過多種途徑給藥，無明顯不良反應(yīng)，因此在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中有一定的應(yīng)用前景。作為一種內(nèi)源性因子，M'I’在其他細胞的保護作用已經(jīng)得到證實，但它對腦內(nèi)的NSCs和神經(jīng)發(fā)生是否產(chǎn)生影響未見報道。本研究設(shè)計了體內(nèi)、外試驗，觀察MT對NSCs增殖和分化的影響，同時觀察MT及其聯(lián)

5、合羊膜細胞移植對MPTP致PD小鼠的療效，試圖探討其可能的作用機制。 第一部分MT對大鼠胚胎中腦NSCs增殖和分化的影響 1．從大鼠胚胎中腦分離培養(yǎng)NSCs，免疫熒光實驗證實，NSCs及其增殖形成的神經(jīng)球都表達標(biāo)志性抗原巢素(Nestin)。PCR-ELISA方法表明培養(yǎng)的NSCs呈現(xiàn)高水平的端粒酶活性。說明我們培養(yǎng)的細胞是NSCs。 2．通過相差顯微鏡觀察，我們發(fā)現(xiàn)與對照組相比，MT不僅顯著提高總神經(jīng)細胞球的數(shù)

6、量，還可以提高大細胞球的比率；采用MTS的方法觀察到MT(0.05、0.1和1 nM)可以劑量依賴性地增加NSCs的OD值。說明MT有促進NSCs增殖的作用。 3．采用MTS的方法觀察到MPP<'+>(1、10、50和100μM)明顯降低NSCs的細胞活性；當(dāng)加入MT(0.1和1 nM)與細胞作用1h后，OD值與MPP<'+>(50μM)組相比明顯升高，說明MT能有效對抗MPP<'+>對NSCs的毒性作用。 4．NSCs

7、在含MT(1nM)的分化培養(yǎng)基中生長6d后，采用細胞免疫熒光、RT-PCR和western blot方法，均觀察到分化細胞中TH的表達明顯增加，GFAP顯著降低。說明MT在促進NSCs向多巴胺能神經(jīng)元分化的同時抑制其向星形膠質(zhì)細胞的分化。 5．通過RT-PCR方法，檢測到NSCs可以表達MT的兩個受體的亞型-MT1和MT2。同時觀察到MT(1nM)可明顯促進BDNF和GDNF的表達，這可能與MT調(diào)節(jié)NSCs增殖和分化有關(guān)。

8、 第二部分羊膜組織細胞的神經(jīng)生物學(xué)特性 1．通過免疫組織化學(xué)染色方法，證明羊膜組織細胞中存在MAP2、NeuN、β-Tubullin-Ⅲ、TH、CNPase和GFAP等陽性細胞。說明羊膜組織細胞具有神經(jīng)生物學(xué)特性。 2．羊膜組織細胞中還存在Nestin、Musashi-1、Vimentin和PSA-NCAM陽性細胞，同時發(fā)現(xiàn)以上陽性細胞部分呈現(xiàn)與BrdU免疫熒光雙標(biāo)陽性；而且檢測到培養(yǎng)的HACs可以表達Nestin m

9、RNA。這些結(jié)果提示羊膜組織細胞可表達神經(jīng)干細胞的特異性蛋白，并且具有增殖活性。 3．培養(yǎng)的HACs中存在BrdU與Tubulin、TH、CNPase和GFAP雙標(biāo)染色陽性細胞，RT-PCR方法可見GFAP mRNA的表達。說明這些增殖的羊膜細胞可以分化為神經(jīng)元、多巴胺能神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞，進一步表明其多分化潛能。 第三部分羊膜細胞移植合并褪黑素治療MPTP致PD小鼠模型的實驗研究 1．以MPq

10、、P(15mg/kg，i.p.，x4次)處理雄性C57BL/6小鼠，成功制備了PD小鼠模型。與對照組相比，行為學(xué)檢測表現(xiàn)為轉(zhuǎn)桿次數(shù)(16 rpm和20 rpm)明顯減少，自發(fā)運動次數(shù)亦明顯減少，Morris水迷宮實驗尋臺潛伏期和游泳路程明顯延長。 2．組織形態(tài)學(xué)表明，PD模型鼠腦紋狀體和黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元有明顯損傷，表現(xiàn)為尼氏小體藍色顆粒減少、細胞核濃縮和胞漿空泡樣變性。TH免疫組織化學(xué)和免疫熒光化學(xué)染色顯示多巴胺神經(jīng)元數(shù)目明顯減少。

11、 3．經(jīng)HACs移植、MT及二者聯(lián)合治療2-4w后，可使MPTP-PD小鼠的上述行為學(xué)和形態(tài)學(xué)的改變均得到不同程度的改善。 4．HACs及與MT聯(lián)合移植組小鼠紋狀體區(qū)內(nèi)可見HNA和HMA陽性標(biāo)記的細胞，并可見PKH26/TH雙標(biāo)陽性細胞的存在，說明移植成活的HACs部分已分化為多巴胺能神經(jīng)元。 5．HACs移植、MT和二者聯(lián)合治療可以提高紋狀體區(qū)神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF和GDNF的表達，并明顯促進SVZ區(qū)BrdU陽性

12、細胞的增加。 6．本研究提示，HACs移植以及與MT聯(lián)合應(yīng)用，可能是通過增加神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達和促進SVZ區(qū)的細胞增殖，發(fā)揮治療PD的協(xié)同作用。 綜上所述，本研究通過體外實驗表明MT可以促進NSCs的增殖，并對MPP<'+>損傷模型發(fā)揮保護作用；同時促進NSCs向多巴胺能神經(jīng)元分化，而降低向星形膠質(zhì)細胞的分化。這可能與MT促進NSCs表達神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF和GDNF有關(guān)。HACs具有神經(jīng)生物學(xué)特性，其單獨移植以及與MT