神經(jīng)嵴樣干細(xì)胞參與肌腱自發(fā)修復(fù)的機(jī)制及其應(yīng)用于肌腱再生的實驗研究.pdf

1、肌腱/韌帶損傷是一個非常常見的臨床問題,約占骨科病例的一半左右。目前的治療方法主要停留在理療、手術(shù)縫合以及自體、異體或假體移植階段,雖有一定療效,但作用有限,有待于開發(fā)更完善的治療方法。但是,目前對肌腱損傷修復(fù)機(jī)理的了解有限,阻礙了新療法的開發(fā)。近年來肌腱干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn),為肌腱損傷的治療提供了新的視角。本研究擬從肌腱損傷后自發(fā)修復(fù)的角度出發(fā),探索此進(jìn)程中肌腱干細(xì)胞的參與機(jī)制,進(jìn)而嘗試將此類干細(xì)胞應(yīng)用于肌腱再生。
　　本文的主要工作和

2、結(jié)果如下:
　　1.神經(jīng)嵴樣肌腱干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定。
　　為研究肌腱干細(xì)胞的特性,以大鼠臏腱(patellartendon)為對象,獲取肌腱單細(xì)胞懸液。低密度接種后,細(xì)胞呈克隆生長,呈現(xiàn)5種克隆形態(tài),克隆形成率為5-8％,表明肌腱源細(xì)胞具有克隆形成能力;懸浮成球培養(yǎng),細(xì)胞成克隆球生長,傳代后繼續(xù)成球生長,表明肌腱源細(xì)胞具有自我更新能力;多向分化檢測,肌腱源細(xì)胞具有向骨、軟骨、脂肪、平滑肌、神經(jīng)元、施旺細(xì)胞分化能力,具有

3、多潛能性。因而,本研究分離的肌腱源細(xì)胞符合干細(xì)胞定義,是一種多能干細(xì)胞。進(jìn)一步鑒定表明,肌腱干細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD54,CD29,不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34和血液細(xì)胞表面標(biāo)志物CD45,CD11b/c,表明本研究培養(yǎng)的干細(xì)胞并非來源于血管內(nèi)皮或血液譜系細(xì)胞;免疫熒光檢測表明,此類干細(xì)胞表達(dá)肌腱細(xì)胞相關(guān)蛋白Decorin,說明肌腱干細(xì)胞仍具有肌腱譜系的特性;此外還表達(dá)神經(jīng)嵴干細(xì)胞標(biāo)志物P75、Vimentin、Snail和S

4、ox10,表明肌腱干細(xì)胞具有神經(jīng)嵴干細(xì)胞樣特性。綜上,本研究分離培養(yǎng)的肌腱來源的干細(xì)胞,具有向間充質(zhì)譜系和神經(jīng)譜系分化的能力,且表達(dá)神經(jīng)嵴干細(xì)胞的標(biāo)志物,因而,本文將其命名為神經(jīng)嵴樣肌腱干細(xì)胞(neuralcrest-liketendonstemcells,NCL-TSCs)。
　　2.神經(jīng)嵴樣干細(xì)胞參與肌腱損傷后的自發(fā)修復(fù)。
　　為探索NCL-TSCs在體內(nèi)的定位,本研究以大鼠臏腱為對象,以α-smoothmuscleac

5、tin(SMA)為血管細(xì)胞標(biāo)志物、p75neurotrophinreceptor(P75)為NCL-TSCs標(biāo)志物,行冰凍切片免疫熒光。結(jié)果顯示,肌腱中SMA+細(xì)胞主要分布于肌腱周邊的滑膜(synovium)部分,其次分布于肌腱實質(zhì)部分(midsubstance)的腱內(nèi)膜(endotenon),P75+細(xì)胞數(shù)量稀少,主要分布于微血管的周圍。為研究P75+細(xì)胞在肌腱自發(fā)修復(fù)中的作用,制造大鼠臏腱開窗缺損建立肌腱損傷模型,冠狀面切片顯示,損

6、傷后滑膜增生,伴隨著滑膜向缺損部位的浸潤,血管細(xì)胞遷入損傷部位,同時P75+細(xì)胞大量出現(xiàn)。超微觀察顯示,這些P75+細(xì)胞可能來自于血管周圍,在損傷后離開血管壁,進(jìn)入間質(zhì),且產(chǎn)生大量的ECM,參與肌腱的自發(fā)修復(fù)進(jìn)程。流式分選這群P75+細(xì)胞,鑒定表明其表達(dá)一系列神經(jīng)嵴干細(xì)胞標(biāo)志物。
　　3.誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞來源的神經(jīng)嵴干細(xì)胞促進(jìn)損傷肌腱的再生。
　　為進(jìn)一步探索神經(jīng)嵴樣干細(xì)胞在肌腱修復(fù)中的應(yīng)用,本研究以誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞來源的神

7、經(jīng)嵴干細(xì)胞(inducedpluripotentstemcell-derivedneuralcreststemcells,iPSC-NCSCs)為種子細(xì)胞;制造大鼠臏腱開窗缺損,填充iPSC-NCSCs/水凝膠復(fù)合物,建立肌腱再生動物模型,研究iPSC-NCSCs再生肌腱能力。術(shù)后4周外觀觀察,與對照組相比iPSC-NCSCs處理組肌腱修復(fù)更完全。組織學(xué)分析顯示,iPSC-NCSCs能促進(jìn)損傷部位膠原的生成。肌腱相關(guān)ECM蛋白分析表明,

8、iPSC-NCSCs能增強(qiáng)損傷部位ECM的沉積。力學(xué)測試表明,iPSC-NCSCs處理組肌腱表現(xiàn)出更好的生物力學(xué)特性。進(jìn)一步探討iPSC-NCSCs促進(jìn)肌腱修復(fù)的潛在機(jī)制,結(jié)果表明植入后的iPSC-NCSCs通過在損傷肌腱中分化產(chǎn)生肌腱相關(guān)蛋白直接參與再生,同時還產(chǎn)生一系列干細(xì)胞招募因子和腱系分化因子,可能激活宿主干細(xì)胞并誘導(dǎo)其分化,進(jìn)而促進(jìn)宿主自身的修復(fù)。
　　總之,本文系統(tǒng)研究了肌腱中棲息的神經(jīng)嵴樣干細(xì)胞的特性,初步探明了其在