NGAL噬菌體單鏈抗體的篩選、表達(dá)及其在免疫膠體金檢測方法中的初步應(yīng)用.pdf

1、人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)與炎癥、胚胎發(fā)育、免疫應(yīng)答、趨化作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展等過程密切相關(guān)，是新的早期腎損傷生化標(biāo)志物。本研究旨在應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)篩選NGAL特異性抗體，并建立免疫膠體金檢測技術(shù)，為體內(nèi)NGAL變化水平的檢測提供方法，為急性腎損傷的診斷提供幫助。
　　本論文采用免疫的Balb/C小鼠，從其

2、脾臟中提取總RNA，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，通過設(shè)計(jì)的簡并引物來擴(kuò)增輕鏈可變區(qū)(VL)和重鏈可變區(qū)(VH)，經(jīng)過重疊延伸PCR方法連接為單鏈抗體基因(scFv)。經(jīng)sfiⅠ、XbaⅠ雙酶切后連接到噬菌體載體pCantab5E中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1成功構(gòu)建了庫容為5×107 pfu的鼠源噬菌體抗體庫。經(jīng)過PCR檢測，抗體庫的插入率為85％。隨機(jī)挑取部分單克隆測序分析發(fā)現(xiàn)抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)序列均不相同，說明了本研究構(gòu)建的鼠源噬菌體抗體庫

3、多樣性較好。
　　以重組蛋白NGAL作為靶蛋白對噬菌體抗體庫進(jìn)行了四輪富集，從第四輪篩選后的抗性平板上挑取了30個單克隆進(jìn)行了噬菌體抗體ELISA鑒定，將陽性克隆構(gòu)建CHO細(xì)胞表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中并進(jìn)行壓力篩選、重組表達(dá)，對表達(dá)純化后的抗體進(jìn)行了SDS-PAGE、ELISA效價(jià)及親和力分析。結(jié)果表明，單克隆有11個為強(qiáng)陽性。ELISA測定抗體效價(jià)為1∶107，抗體親和力為6.532×10-9 M。表明本論文成功獲得了NGA

4、L基因工程抗體，為NGAL檢測診斷方法的建立提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　應(yīng)用重組表達(dá)的抗體與實(shí)驗(yàn)室制備的多抗，建立了NGAL免疫膠體金檢測方法。確定了免疫膠體金層析方法最優(yōu)條件:金標(biāo)抗體標(biāo)記量12μg/mL，金標(biāo)抗體的穩(wěn)定劑為0.08％的PEG-20000，金標(biāo)抗體的保存液為20 mM pH8.2硼酸緩沖液(含0.01％ Na2N3、0.08％PEG-20000);結(jié)合墊處理液為20 mM pH9.0 Tris-HCl(含0.5％PVP

5、-40、0.5％Trion)、樣品墊處理液為0.01 mol/L pH7.4 TBS(含1％ BSA、0.05％ Tween20)、金標(biāo)抗體噴涂量為0.5μL/mL、羊抗NGAL抗體噴涂量為1.2μg/mL、羊抗人的IgG噴涂量為4μg/mL。將試紙條分別置于37℃及4℃密封干燥避光保存，到第20周其敏感性和特異性均沒有降低。使用該試紙條對40份臨床樣本進(jìn)行了檢測，結(jié)果與臨床檢測結(jié)果完全一致。上述結(jié)果表明，本論文建立的免疫膠體金檢測方法