亞急性皮膚型紅斑狼瘡?fù)庵苎猅細(xì)胞DNA甲基化異常的研究.pdf

1、亞急性皮膚型紅斑狼瘡（SCLE）是紅斑狼瘡（lupus erythematosus，LE）的一個(gè)亞型，與系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者相比，大部分SCLE患者病情一般進(jìn)展較慢或者相對(duì)溫和，很少出現(xiàn)嚴(yán)重內(nèi)臟器官受累的情況，如SLE患者經(jīng)常出現(xiàn)的腎臟受累、心血管受累或中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累等。但是，也有部分SCLE患者的病情在經(jīng)過多年的慢性發(fā)展過程后，會(huì)逐漸轉(zhuǎn)變成SLE，并出現(xiàn)與SLE患者一樣的系統(tǒng)受累的情況。盡管LE的病因尚不清楚，但近年來，越來

2、越多的研究表明表觀遺傳機(jī)制，特別是T細(xì)胞DNA低甲基化在T細(xì)胞基因調(diào)控及SLE發(fā)病中起著十分重要的作用，而T細(xì)胞DNA低甲基化是否在SCLE的發(fā)生、發(fā)展中起作用？目前國(guó)內(nèi)外尚無相關(guān)的研究報(bào)道。 DNA甲基化是重要的表觀遺傳學(xué)機(jī)制之一，在胚胎發(fā)育、遺傳印記、X染色體失活、染色質(zhì)重塑等方面起重要作用。DNA甲基化是指以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作為甲基供體，將其甲基轉(zhuǎn)移到DNA脫氧胞嘧啶（deocytosine）的第5位碳原子，形成

3、5-甲基胞嘧啶（5-mC）的化學(xué)修飾過程，通常發(fā)生在二核苷酸CpG中的胞嘧啶?；騿?dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域CpG島的甲基化可以使一些轉(zhuǎn)錄因子無法與DNA結(jié)合而抑制基因的轉(zhuǎn)錄。 DNA甲基化狀態(tài)受到DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的調(diào)控，人類DNMT家族成員主要包括DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。DNMT1為維持型甲基轉(zhuǎn)移酶，即使半甲基化的雙鏈DNA變成完全甲基化的雙鏈DNA，確保體內(nèi)特異

4、甲基化方式在DNA復(fù)制過程中得到傳遞；而DNMT3a與DNMT3b屬于新生型甲基轉(zhuǎn)移酶，即催化非甲基化的DNA成為甲基化的DNA狀態(tài)。近年來，研究結(jié)果表明SLE患者T細(xì)胞中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）活性僅為正常人的1/3-1/2，DNMT1的表達(dá)下降，在SLE患者T細(xì)胞的甲基化中起重要作用。甲基化修飾后的DNA對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控還需要特異結(jié)合于甲基化CpG位點(diǎn)（methyl-CpG，mCpG）的蛋白因子參與，因?yàn)檫@些都含有一同樣的甲基C

5、pG結(jié)合結(jié)構(gòu)域（MBD），又被稱為MBD蛋白家族，包括MBD1，MBD2，MBD3，MBD4和MeCP2。MBD蛋白通過選擇性結(jié)合甲基化的DNA，與一些相關(guān)蛋白協(xié)同影響DNA甲基化、染色質(zhì)構(gòu)型和基因轉(zhuǎn)錄。有報(bào)道SLE患者CD4+T細(xì)胞MBD2和MBD4的表達(dá)增加，并認(rèn)為其在T細(xì)胞的甲基化中發(fā)揮重要的作用。 近年來的越來越多的研究結(jié)果表明T細(xì)胞DNA甲基化異常在SLE發(fā)病中起十分重要的作用。用DNA甲基化抑制劑處理鼠或人T細(xì)胞后，

6、可以使T細(xì)胞發(fā)生低甲基化，誘發(fā)狼瘡樣的自身免疫反應(yīng)。而SLE病人T細(xì)胞亦表現(xiàn)出總體的基因組低甲基化和自身免疫相關(guān)基因的低甲基化，這些基因包括CD11a（ITGAL）、CD70（TNFSF7）、CD40L（TNFSF5）和Perforin（PRF1），過度表達(dá)這些基因的T細(xì)胞具有自身反應(yīng)性，殺傷自身巨噬細(xì)胞或輔助B細(xì)胞產(chǎn)生大量的自身抗體，在SLE的發(fā)生、發(fā)展中起十分重要的作用。 SCLE發(fā)病的遺傳與表觀遺傳因素目前仍不清楚。為了探

7、討DNA甲基化異常在SCLE發(fā)病中的作用及機(jī)制，本課題研究了SCLE患者外周血T細(xì)胞基因組DNA總體甲基化水平以及DNMTsmRNA和MBDsmRNA表達(dá)水平，同時(shí)檢測(cè)了CD11a、CD70、CD40L和Perforin這些自身免疫密切相關(guān)基因的表達(dá)水平及其調(diào)節(jié)序列的甲基化狀態(tài)，并分析基因調(diào)節(jié)序列的甲基化水平與其表達(dá)水平的關(guān)系。 第一部分SCLE患者外周血T細(xì)胞DNA總體甲基化異常的研究 目的：研究亞急性皮膚型紅斑狼瘡患

8、（SCLE）患者T細(xì)胞DNA總體甲基化狀態(tài)以及甲基化相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)，從而探討SCLE的表觀遺傳學(xué)改變。 方法：密度梯度離心分離12例SCLE患者和9例正常人的外周血單個(gè)核細(xì)胞，磁珠分選CD4+和CD8+T細(xì)胞，然后用總體甲基化定量試劑盒檢測(cè)SCLE患者和正常對(duì)照CD4+和CD8+T細(xì)胞的DNA總體甲基化水平，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-timeRT-PCR）檢測(cè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）和甲基結(jié)合蛋白（MBDs）的m

9、RNA表達(dá)。 結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，SCLE患者CD4+T細(xì)胞基因組DNA總體低甲基化（P=0.002），而CD8+T細(xì)胞的基因組DNA總體甲基化水平無明顯變化（P=0.231）；SCLE患者CD4+T細(xì)胞DNMT1和DNMT3a的mRNA水平明顯降低（P值分別為p=0.027和p=0.004），MBD1，MBD3和MBD4mRNA明顯增高（P值分別為p<0.001，p<0.001和p=0.001）；SCLE患者CD8+T細(xì)胞

10、MECP2mRNA和MBD4mRNA表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯增高（P值均為p=0.001）；我們還發(fā)現(xiàn)SCLE患者CD4+T細(xì)胞DNA總體甲基化水平與DNMT1mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.590，p=0.044）。 結(jié)論：SCLE患者CD4+T細(xì)胞基因組DNA低甲基化，且甲基化相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)異常。 第二部分SCLE患者T細(xì)胞自身免疫反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)及其調(diào)節(jié)序列甲基化狀態(tài)的研究 目的：研究SCLE患者外周血

11、T細(xì)胞CD11a，CD70，CD40L及Perforin表達(dá)及其調(diào)節(jié)序列的甲基化狀態(tài)。 方法：密度梯度離心分離12例SCLE患者和9例正常人的外周血單個(gè)核細(xì)胞，用流式細(xì)胞檢測(cè)PBMC中CD11a，CD70，CD40L及Perforin蛋白在CD4+和CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)水平；磁珠分選CD4+和CD8+T細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-timeRT-PCR）檢測(cè)CD11a，CD70，CD40L及Perforin的mRNA表