系統(tǒng)性紅斑狼瘡CD4+T細(xì)胞全基因組DNA羥甲基化研究.pdf

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種經(jīng)典的自身免疫性疾病，以血清中出現(xiàn)多種自身抗體和多器官受累為主要特征。該病好發(fā)于生育年齡女性，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，且不能根治，嚴(yán)重危害著廣大患者的身心健康。目前，系統(tǒng)性紅斑狼瘡確切的病因和發(fā)病機(jī)制尚不明了，近年來越來越多的研究表明，表觀遺傳學(xué)機(jī)制，特別是CD4+T細(xì)胞基因異常低甲基化在該病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域最早發(fā)

2、現(xiàn)的、也是研究得最為成熟的DNA修飾現(xiàn)象。一般認(rèn)為，基因調(diào)控序列的DNA甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄;反之，DNA去甲基化則激活基因的表達(dá)。我們的課題組經(jīng)過多年研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者CD4+T細(xì)胞中與自身免疫反應(yīng)相關(guān)的CD11a、CD70等基因調(diào)控序列DNA甲基化水平異常降低，導(dǎo)致基因過度表達(dá)，誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞具有自身反應(yīng)性，殺傷自身巨噬細(xì)胞或過度輔助自身B細(xì)胞產(chǎn)生大量的自身抗體，從而誘發(fā)或加重自身免疫反應(yīng)?？梢?，CD4+T細(xì)胞中特定基因調(diào)控序列

3、病理性低甲基化是致使SLE發(fā)病的重要分子機(jī)制之一。然而，導(dǎo)致SLECD4+T細(xì)胞基因甲基化狀態(tài)異常的具體機(jī)制至今仍未完全闡明。
　　DNA羥甲基化是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)節(jié)DNA甲基化的方式，該過程的產(chǎn)物——5-羥甲基胞嘧啶作為一種新的DNA堿基修飾形式，被喻為基因組中的“第六種堿基”。DNA中5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)被雙加氧酶家族TET(ten-eleven translocation)蛋白進(jìn)一步

4、氧化，即成為5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5hmC)。研究表明，5hmC可能參與DNA去甲基化和基因表達(dá)調(diào)控。一方面，5hmC可能作為中間產(chǎn)物參與主動(dòng)或被動(dòng)去甲基化過程;另一方面，5hmC可能通過取代5mC修飾而解除后者所發(fā)揮的生物學(xué)作用，或自身招募其他效應(yīng)蛋白來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄?？傊?，5hmC對(duì)DNA去甲基化和基因表達(dá)調(diào)控起著十分重要的生物學(xué)作用。作為表觀遺傳學(xué)的前沿與熱點(diǎn)研究?jī)?nèi)容，DNA羥甲基化無疑潛

5、藏著許多新的表觀遺傳特性及信息有待發(fā)掘。結(jié)合我們前期研究發(fā)現(xiàn)的SLE與某些基因調(diào)控序列DNA異常甲基化狀態(tài)及基因調(diào)控之間的密切關(guān)系，我們推測(cè)DNA羥甲基化很可能在SLE的發(fā)病過程中扮演著重要角色，或是通過改變DNA甲基化狀態(tài)、或是通過自身獨(dú)立的基因調(diào)控途徑。鑒于目前尚未有任何關(guān)于DNA羥甲基化在SLE中的研究及相關(guān)信息報(bào)道，本課題擬首次通過羥甲基化DNA免疫共沉淀芯片hMeDIP-chip檢測(cè)5hmC在SLE患者及正常人CD4+T細(xì)胞全

6、基因組范圍的分布情況，獲得SLE CD4+T細(xì)胞DNA羥甲基化差異圖譜，并進(jìn)一步探究DNA羥甲基化在SLE自身免疫反應(yīng)發(fā)病機(jī)制中的作用，為SLE的診治尋找有效的新途徑并提供理論依據(jù)。
　　第一章系統(tǒng)性紅斑狼瘡CD4+T細(xì)胞全基因組DNA羥甲基化譜
　　第一節(jié)系統(tǒng)性紅斑狼瘡CD4+T細(xì)胞全基因組DNA羥甲基化圖譜
　　目的:研究SLE患者及正常人CD4+T細(xì)胞中的DNA羥甲基化狀態(tài)，探討DNA羥甲基化在SLE發(fā)生發(fā)展過程

7、中的作用及機(jī)制。
　　方法 Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離5例SLE患者和5例正常人的外周血單個(gè)核細(xì)胞，免疫磁珠分離法獲得CD4+T細(xì)胞。hMeDIP-chip芯片檢測(cè)全基因組DNA羥甲基化狀態(tài)。
　　結(jié)果:hMeDIP-chip芯片結(jié)果顯示，共3083個(gè)基因在SLE患者與正常人CD4+T細(xì)胞之間存在啟動(dòng)子區(qū)DNA羥甲基化水平的不同，其中3030個(gè)基因是在SLE患者中表現(xiàn)出DNA高羥甲基化狀態(tài)，并主要分布在高

8、CpG含量啟動(dòng)子區(qū);共4646個(gè)基因在SLE患者與正常人CD4+T細(xì)胞CpG島中存在DNA羥甲基化水平的不同，其中4643個(gè)基因是在SLE患者中表現(xiàn)出DNA高羥甲基化狀態(tài)，且多發(fā)生在基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島。GO分析顯示羥甲基化異常改變明顯的基因多與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞代謝、發(fā)育等內(nèi)容相關(guān)。KEGG pathway分析顯示羥甲基化差異基因多涉及腫瘤、細(xì)胞增殖和胚胎發(fā)育、TGF-β等相關(guān)的信號(hào)通路。
　　結(jié)論:SLE CD4+T細(xì)胞基因

9、啟動(dòng)子區(qū)、CpG島均呈DNA高羥甲基化水平，DNA高羥甲基化狀態(tài)可能在SLE發(fā)生發(fā)展中起重要作用。
　　第二節(jié)系統(tǒng)性紅斑狼瘡CD4+T細(xì)胞PPARG、MALT1和LRF2BP2基因啟動(dòng)子區(qū)DNA羥甲基化水平研究
　　目的:選擇PPARG、MALT1和IRF2BP2三個(gè)基因在SLE患者和正常人CD4+T細(xì)胞中對(duì)DNA羥甲基化芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。
　　方法:選取10例SLE患者和10例正常人作為研究對(duì)象，F(xiàn)icoll-Hyp

10、aque密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，免疫磁珠分離法獲得CD4+T細(xì)胞，羥甲基化DNA免疫共沉淀法檢測(cè)基因PPARG、MALT1和IRF2BP2啟動(dòng)子區(qū)的DNA羥甲基化水平。
　　結(jié)果:與正常對(duì)照相比，SLE患者CD4+T細(xì)胞中基因PPARG、MALT1和IRF2BP2的啟動(dòng)子區(qū)均表現(xiàn)出DNA高羥甲基化狀態(tài)(11.695±2.292 vs5.682±1.645, p=0.000;1.838±0.562 vs0.989±0.3

11、26,p=0.001;0.194±0.049 vs0.124±0.031, p=0.001)。
　　結(jié)論:羥甲基化DNA免疫共沉淀法驗(yàn)證了SLE CD4+T細(xì)胞中PPARG、MALT1和IRF2BP2基因啟動(dòng)子區(qū)呈高羥甲基化狀態(tài)，其結(jié)果與hMeDIP-chip芯片結(jié)果一致。
　　第二章系統(tǒng)性紅斑狼瘡CD4+T細(xì)胞PPARG、MALT1和IRF2BP2基因表達(dá)及其與DNA羥甲基化相關(guān)性分析
　　目的:研究SLE患者和正常

12、人CD4+T細(xì)胞中基因PPARG、 MALT1和IRF2BP2的表達(dá)水平及其與DNA羥甲基化的相關(guān)性。
　　方法:Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離13例SLE患者和13例正常人的外周血單個(gè)核細(xì)胞，免疫磁珠分離法獲得CD4+T細(xì)胞，TRIzol法提取CD4+T細(xì)胞RNA， Real-time PCR檢測(cè)基因PPARG、MALT1和IRF2BP2 mRNA表達(dá)水平，并對(duì)DNA羥甲基化和基因表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　

13、結(jié)果:與正常對(duì)照相比，SLE患者CD4+T細(xì)胞中PPARG mRNA和MALT1 mRNA表達(dá)水平顯著升高(p=0.001;p=0.001); SLE患者CD4+T細(xì)胞中基因IRF2BP2 mRNA表達(dá)水平也高于正常對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.332)。相關(guān)性分析顯示，PPARG和MALT1基因啟動(dòng)子區(qū)DNA羥甲基化水平與其mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(PPARG:R=0.713，p=0.021; MALT1:R=0.684, p=