香菇C91-3菌株Latcripin-11基因的預(yù)測(cè)分析、克隆表達(dá)及活性鑒定研究.pdf

1、背景：
　　香菇（Lentinula edodes）是具有豐富營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值的食用真菌，是全球第二大食用菌，被稱(chēng)作“山珍之王”、“真菌皇后”。香菇具有獨(dú)特香氣和鮮美的味道，被我國(guó)最早開(kāi)發(fā)人工栽植，是食用佳肴。我國(guó)古代醫(yī)者即對(duì)香菇著有論述，稱(chēng)香菇性平味甘，能夠增進(jìn)食欲、補(bǔ)氣益力?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)和營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究學(xué)者也將香菇作為藥食同源的重要食材開(kāi)發(fā)研究。
　　香菇屬于擔(dān)子菌門(mén)傘菌綱傘菌目光茸菌科香菇屬。子實(shí)體較大，肉厚細(xì)密。營(yíng)養(yǎng)豐富，

2、含有豐富的鈣、磷、鐵、維生素和粗纖維。蛋白含量較高，種類(lèi)豐富，含有18種氨基酸和30多種酶，其中包括了人體8種必需氨基酸中的7種，能夠糾正酶缺乏癥、輔助補(bǔ)充氨基酸。據(jù)古籍記載，香菇益胃助食、破血治風(fēng)，預(yù)防麻疹痘瘡、治療頭暈頭痛?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)和生物科學(xué)研究針對(duì)香菇具體成分分解研究發(fā)現(xiàn)香菇多糖具有免疫調(diào)節(jié)能力，能夠抗炎抗腫瘤；香菇麥角甾醇能夠預(yù)防佝僂?。幌愎街舅崮軌蚪档腿梭w血脂等。此外香菇提取物還在抗輻射、抗衰老、降血壓、神經(jīng)炎、肝炎、動(dòng)脈硬

3、化預(yù)防治療等方面發(fā)揮積極的作用。但對(duì)于香菇中蛋白成分的功能性研究較為鮮見(jiàn)。
　　香菇C91-3是本課題組在1991年3月從多株香菇中篩選得到的具有抗腫瘤作用的菌株，命名為“香菇C91-3”，C代表China，即中國(guó)。通過(guò)分析香菇菌絲體發(fā)酵液成分，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中除含有氨基酸、多糖等組份外，還含有多種蛋白質(zhì)組分。發(fā)酵液經(jīng)分離后其中的蛋白質(zhì)成分具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。為了進(jìn)一步探索香菇C91-3菌絲體中功能蛋白的活性和作用機(jī)制，深入、具體

4、、準(zhǔn)確的開(kāi)展香菇蛋白的抗腫瘤研究，快速獲取有抗腫瘤功效的單一蛋白組份，本課題組從基因序列著手尋找功能蛋白，采用SOLEXA高通量測(cè)序方法獲取香菇C91-3菌絲體的基因序列。通過(guò)比對(duì)分析篩選出具有抗腫瘤功能潛力的基因開(kāi)展深入研究。
　　目的：
　?。?）在SOLEXA高通量測(cè)序基礎(chǔ)上通過(guò)分析比對(duì)，篩選出具有AhpC/TSA家族功能域的基因序列Latcirpin-11（Lp-11），利用生物信息學(xué)在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)分析Lp-11的結(jié)構(gòu)

5、、功能和活性，評(píng)估其開(kāi)發(fā)價(jià)值。
　?。?）獲取Lp-11基因序列，構(gòu)建原核表達(dá)載體誘導(dǎo)表達(dá)獲取目的蛋白Lp-11蛋白，復(fù)性純化。
　　（3）依據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析結(jié)果對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)功能驗(yàn)證。
　　方法：
　?。?）在SOLEXA高通量測(cè)序的基礎(chǔ)上，通過(guò)比對(duì)分析篩選出具有AhpC/TSA家族功能域的基因序列Lp-11。采用多種在線(xiàn)預(yù)測(cè)分析軟件，如NPS@:SOPMA secondary structure pred

6、iction、Swiss-Model、通過(guò)Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析等對(duì)Lp-11基因序列、蛋白序列、蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，分析其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，以此為基礎(chǔ)再通過(guò)InterPro、CBS、Bioinfo、TargetP、Propen等軟件對(duì)Lp-11蛋白活性效應(yīng)、功能注解進(jìn)行全面分析，評(píng)估Lp-11基因序列功能活性研究潛力。
　?。?）采用RACE方法獲取Lp-11基因片段，通過(guò)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的pET系統(tǒng)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a（+）

7、-Lp-11，轉(zhuǎn)化到E.coli.Rosetta-gami(DE3)中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲得包涵體蛋白，經(jīng)2M尿素洗滌、8M尿素溶解后，通過(guò)尿素梯度復(fù)性方法使蛋白重新折疊，恢復(fù)空間結(jié)構(gòu)；利用His標(biāo)簽采用鎳柱親和層析方法對(duì)蛋白進(jìn)行純化，獲取Lp-11蛋白并采用Weastern Blot和圓二色譜分析法進(jìn)行鑒定。
　?。?）Lp-11蛋白的活性鑒定。通過(guò)標(biāo)記異硫氰酸熒光素（FITC）檢測(cè)Lp-11蛋白的細(xì)胞分布情況；采用1,1-二苯

8、基-2-苦基肼基自由基（DPPH）實(shí)驗(yàn)和DCFH-DA熒光染料檢測(cè)Lp-11蛋白在細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)清除自由基的能力；通過(guò)檢測(cè)Lp-11蛋白作用后細(xì)胞中超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽還原酶活性、總抗氧化能力和過(guò)氧化氫含量判斷Lp-11蛋白的氧化還原能力；通過(guò)Cell Counting Kit-8（CCK-8）檢測(cè)Lp-11蛋白對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用；通過(guò)光鏡觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、透射電鏡觀(guān)察細(xì)胞用藥前后亞微結(jié)構(gòu)的變化、Hoechst33258熒光染

9、色后熒光顯微鏡觀(guān)察Lp-11蛋白作用后細(xì)胞核的改變；采用Annexin V-FITC/PI染色，利用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡狀態(tài)；通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)PI單染對(duì)細(xì)胞的周期改變進(jìn)行分析；通過(guò)JC-1在不同電位下多聚體與單體之間的變化導(dǎo)致熒光變化來(lái)分析細(xì)胞在藥物作用前后線(xiàn)粒體膜電位變化；通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)Lp-11蛋白作用前后，細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的變化；采用Weastern Blot方法分析細(xì)胞中Bcl-2

10、家族蛋白含量的變化；通過(guò)ELISA法檢測(cè)細(xì)胞中和線(xiàn)粒體中細(xì)胞色素C的變化。
　　結(jié)果：
　　（1）生物信息學(xué)分析Lp-11蛋白結(jié)構(gòu)具有空間穩(wěn)定性，能夠進(jìn)入細(xì)胞，在胞漿中分布。具有線(xiàn)粒體相關(guān)信號(hào)肽以及7個(gè)蛋白結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)核酸結(jié)合位點(diǎn)。具有類(lèi)似于A(yíng)hpC/TSA家族的功能域，具有脫氫還原的能力。Lp-11蛋白具有深入研究?jī)r(jià)值。
　?。?）成功獲取Lp-11基因片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a（+）-Lp-11后轉(zhuǎn)化到E.c

11、oli.Rosetta-gami(DE3)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲得包涵體蛋白，尿素洗滌溶解后梯度復(fù)性、鎳柱親和層析純化，圓二色譜分析鑒定成功獲得具有空間結(jié)構(gòu)的Lp-11蛋白。
　　（3）Lp-11蛋白能夠進(jìn)入細(xì)胞，分布在胞漿中，具有提高細(xì)胞內(nèi)氧化還原酶活性和總抗氧化能力的功能，同時(shí)能夠有效清除細(xì)胞中的活性氧自由基。對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制生長(zhǎng)的作用，其中U937細(xì)胞的抑制生長(zhǎng)率最高，但對(duì)正常細(xì)胞具有促進(jìn)生長(zhǎng)的作用。通過(guò)線(xiàn)粒體途徑誘導(dǎo)