CXCL10基因與奶牛乳腺炎易感性-抗性相關(guān)功能性分子標(biāo)記的研究.pdf

1、奶牛乳腺炎是一種常見的癥狀之一，受遺傳、環(huán)境等多種因素的控制，具有復(fù)雜性、多樣性及難愈性等特點(diǎn)，在其發(fā)生過程中有多種免疫相關(guān)基因參與。CXCL10屬于CXC趨化因子超家族的非ELR類，參與多種自身免疫性疾病。CXCL10在中性粒細(xì)胞，樹突細(xì)胞，單核細(xì)胞，上皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，纖維細(xì)胞等細(xì)胞表達(dá)，主要介導(dǎo)Thl型炎性反應(yīng)，趨化趨化白細(xì)胞向炎癥部位聚集，可加強(qiáng)Thl反應(yīng)的進(jìn)程，破壞Th2反應(yīng)的進(jìn)程。借助分子生物學(xué)手段，對此基因從啟動子、miR

2、NA以及SNP等水平上，篩選可用于乳腺炎抗性/易感性的功能性SNPs，并探索基于這些功能性SNPs的分子調(diào)控機(jī)理。主要研究結(jié)果分述如下：
　　1.CXCL10基因的表達(dá)
　　利用平板稀釋計(jì)數(shù)法培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)菌（大腸桿菌和金黃色葡萄球菌），并分別計(jì)算其單位體積中活菌的個(gè)數(shù)（CFU）。將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別以與RAW264.7細(xì)胞的倍數(shù)為：5、15、25、35、45、55和65，感染細(xì)胞1h。提取細(xì)胞中的RNA，進(jìn)行熒光定量P

3、CR。通過熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，無論高濃度還是低濃度菌液感染，CXCL10 mRNA的表達(dá)量均增加，并且其表達(dá)量隨著菌液濃度的增加而升高。同時(shí)提取健康（n=5）和患有乳腺炎（n=5）牛靜脈血中的中性粒細(xì)胞，再提取RNA，進(jìn)行熒光定量PCR，發(fā)現(xiàn)患有乳腺炎個(gè)體中CXCL10 mRNA的表達(dá)量顯著高于健康個(gè)體(P<0.05），表明CXCL10參與乳腺炎的發(fā)生過程，并在免疫過程中發(fā)揮重要的作用。
　　2.CXCL10基因核心啟動子活性分析

4、及功能SNPs的鑒定
　　首先利用在線軟件Genomatix預(yù)測基因CXCL10的啟動子區(qū)（g.-602～g.+102），然后將不同長度的啟動子片段（pGL3-1183，pGL3-958，pGL3-669和pGL3-377）構(gòu)建到pGL3-Basic熒光素酶報(bào)告表達(dá)載體，經(jīng)過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和雙熒光素酶活性測定，鑒定了CXCL10基因核心啟動子區(qū)位于g.-377～g.-1。對核心啟動子區(qū)域進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域存在許多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合

5、位點(diǎn)，如OCT1，E2F和HNF1等，這些轉(zhuǎn)錄因子可能在CXCL10基因轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。PCR擴(kuò)增和序列比對后發(fā)現(xiàn)CXCL10基因核心啟動子區(qū)域存在2個(gè)完全連鎖的SNPs（g.-324 C>A和 g.-163 C>T），并也通過載體構(gòu)建，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和雙熒光素酶活性測定發(fā)現(xiàn)突變型的啟動子活性顯著高于野生型（P<0.05）。軟件分析發(fā)現(xiàn)野生型增加了HNF1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。對SNP（g.-324 C>A和 g.-163 C>T

6、）進(jìn)行基因分型，并將其和SCS進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的突變型型個(gè)體具有較低的SCS。
　　3.CXCL10基因3’UTR和bta-miR-339相關(guān)性研究
　　利用PCR和序列比對的方法發(fā)現(xiàn)在CXCL10基因3’UTR區(qū)域存在一個(gè)SNP（g.+1642 A>G）。通過RNA hybrid和RNA22靶標(biāo)預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)bta-miR-339可以結(jié)合，且發(fā)現(xiàn)bta-miR-339對CXCL10基因3’UTR區(qū)野生型和突變型的結(jié)合

7、能力存在明顯不同，對此SNP進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)突變型（GG）具有較低的體細(xì)胞評分（SCS）（P<0.05）。將含有野生（AA）基因型和突變（GG）基因型的3’UTR中的355bp片段分別連接到PMIR-ReportTM Luciferase表達(dá)載體中，和bta-miR-339真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。通過雙熒光素酶表達(dá)量分析，發(fā)現(xiàn)突變（GG）基因型顯著降低了bta-miR-339與CXCL10基因3’UTR區(qū)域的結(jié)合能力，同時(shí)發(fā)現(xiàn)

8、bta-miR-339可以降低CXCL10基因的表達(dá)。提取分別具有GG、AG和AA基因型個(gè)體乳腺組織中的總RNA，通過RT-PCR和RT-qPCR發(fā)現(xiàn)基因型AA個(gè)體中CXCL10 mRNA的表達(dá)量顯著低于其他基因型（P<0.05）。對SNP g.+1642 A>G進(jìn)行基因分型，并將其和SCS進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的AA型個(gè)體具有較低的SCS。同時(shí)，本研究將CXCL10基因核心啟動子區(qū)和3’UTR區(qū)域的SNPs進(jìn)行單倍型組合關(guān)聯(lián)分析，發(fā)

9、現(xiàn)H1H1，H2H4和H3H4單倍型組合相比于其它單倍型組合表現(xiàn)出較低的SCS（P<0.05）。
　　綜上所述，本研究選取CXCL10作為奶牛乳腺炎抗性候選基因，應(yīng)用PCR和PCR-RFLP手段，進(jìn)行目標(biāo)基因及調(diào)控元件的克隆、SNP篩查及相關(guān)性分析，篩選到顯著影響奶牛乳腺炎的分子標(biāo)記。應(yīng)用生物信息學(xué)預(yù)測了目標(biāo)基因的啟動子區(qū)及靶標(biāo)miRNA，并通過細(xì)胞水平的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，初步證實(shí)了新發(fā)現(xiàn)的分子標(biāo)記的作用機(jī)理，為奶牛乳腺炎抗性的分子標(biāo)記輔