MASP-2變異研究及其與奶牛乳腺炎關(guān)系分析.pdf

1、甘露糖結(jié)合凝集素相關(guān)的絲氨酸蛋白酶-2(mannan binding lectin-associated serine protease2,MASP-2)是補(bǔ)體凝集素溶血途徑中的重要一員,在啟動補(bǔ)體凝集素溶血途徑中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用. MASP-2主要在肝臟中表達(dá),與MBL(Mannan-Binding Lectins)或纖維凝膠蛋白(ficolin)分子結(jié)合形成大分子復(fù)合物,有著重要的生物學(xué)功能.本論文著重研究了以下三個方面:

2、>　　1.MASP-2基因多態(tài)性與奶牛生產(chǎn)性狀關(guān)聯(lián)性分析
　　本課題以759頭中國荷斯坦奶牛為研究對象,檢測了MASP-2基因的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)位點(diǎn),對MASP-2基因多態(tài)性與荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性狀(305天產(chǎn)奶量、乳脂率、乳蛋白率)、SCS(Somatic Cell Score,體細(xì)胞評分)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析,篩選與奶牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)的SNP,意在為未來培育出綠色健康,高產(chǎn)奶量、高乳脂率和高乳蛋白率的荷斯坦奶牛提供可用的分子標(biāo)記

3、和理論依據(jù).
　　經(jīng)DNA測序和相關(guān)目的序列比對發(fā)現(xiàn),MASP-2基因中g(shù).-282 G>A,g.478 G>A,g.506 G>A,g.511 T>C和g.13808 G>A存在5個新的SNP位點(diǎn). g.-282 G>A處于5'側(cè)翼區(qū); g.478 G>A,g.506 G>A,g.511 T>C處于第3外顯子區(qū),其中g(shù).506 G>A突變導(dǎo)致MASP-2蛋白第102位的的甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸,g.478 G>A位點(diǎn)突變后第92位絲

4、氨酸不變,g.511 T>C位點(diǎn)突變后第103位天冬酰胺不變,兩個都為同義突變;g.13808 G>A處于第11外顯子,它的突變能夠?qū)е翸ASP-2蛋白第529位天冬氨酸突變?yōu)樘於０?應(yīng)用PCR-RFLP等試驗(yàn)方法對MASP-2基因進(jìn)行分型后發(fā)現(xiàn),g.-282 G>A,g.478 G>A,g.511 T>C三個SNP位點(diǎn)完全連鎖.數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)MASP-2試驗(yàn)牛群中SNPs組成的單倍型有13種,有7種單倍型組合的數(shù)量滿足統(tǒng)計分析要求,

5、其中H1H2單倍型的產(chǎn)奶量最高,H1H4單倍型的乳脂率最高,H1H8單倍型組合的乳蛋白率最高而且SCS最低,為乳腺炎抗性單倍型組合.2.MASP-2基因可變剪接體的鑒定
　　根據(jù)典型奶牛乳腺炎癥狀和體細(xì)胞評分?jǐn)?shù)據(jù),分別采集3頭健康組(Healthy)和3頭患乳腺炎組(Mastitis)中國荷斯坦牛各組織樣品.經(jīng)RT-PCR和克隆測序后發(fā)現(xiàn)MASP-2基因存在四種可變剪接體,分別命名為MASP-2 A125,MASP-2 A145,

6、MASP-2 A25，MASP-2 A245,全轉(zhuǎn)錄本命名為MASP-2 complete.四種可變剪接體形式分別為內(nèi)含子保留和外顯子缺失.在隨機(jī)挑取的35個單克隆中,四種可變剪接體出現(xiàn)的總頻率為22.9％.五種轉(zhuǎn)錄本均主要在肝臟中表達(dá),分析發(fā)現(xiàn)在乳腺炎牛中MASP-2 complete是主轉(zhuǎn)錄本,在健康牛中MASP-2 complete、MASP-2 A25相對于其它的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量較高.MASP-2 A125,MASP-2 A245轉(zhuǎn)

7、錄本在乳腺炎牛和健康牛中的表達(dá)量存在顯著性差異(P＜0.05),而MASP-2 A25差異極顯著(P＜0.01).
　　3.MASP-2基因啟動子活性分析
　　以?；蚪M序列為基礎(chǔ),克隆了中國荷斯坦奶牛MASP-2基因的上游調(diào)控序列,并利用在線預(yù)測軟件對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,構(gòu)建出了具有不同長度的缺失片段表達(dá)載體,利用雙熒光素酶報告活性系統(tǒng),瞬時轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞(HepG2細(xì)胞)和人胚腎上皮細(xì)胞(293T細(xì)胞)后,分析了MA

8、SP-2上游調(diào)控序列不同長度片段的啟動子活性。
　　研究發(fā)現(xiàn)牛MASP-2基因啟動子的表達(dá)不具有嚴(yán)格的細(xì)胞特異性,在兩種細(xì)胞中都有啟動子活性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該段上游調(diào)控序列雖然在293T細(xì)胞中也有啟動子活性存在,但是活性明顯弱于HepG2細(xì)胞中的啟動子活性,在肝癌細(xì)胞中+245—+577 bp處有基礎(chǔ)啟動子活性。結(jié)果顯示在基因的-1915—1136 bp和-666—-244 bp處存在負(fù)調(diào)控元件,在-1136—-666 bp和-2