梔子及梔翹熱毒平方有效物質(zhì)制備工藝與質(zhì)量控制方法研究.pdf

1、本課題分為六部分。 第一部分文獻(xiàn)研究 總結(jié)了中藥復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)(有效成分)、復(fù)方藥理研究以及復(fù)方新藥研制的思路和方法。綜述了組成梔翹熱毒平方的四個(gè)單味藥梔子、連翹、牛蒡子、黃芩的化學(xué)成分和藥理活性的研究概況。共引用文獻(xiàn)194篇。 第二部分梔子有效部位制備工藝及其質(zhì)量控制方法研究 1建立了梔子有效部位的制備方法。首先優(yōu)化了梔子有效部位的提取工藝，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以浸膏中總環(huán)烯醚萜和梔子苷提取率為評價(jià)指

2、標(biāo)，確定梔子有效部位的最佳提取工藝為：A3％乙醇提取B3次，每次C1小時(shí)，溶劑用量為D1倍量。其次對梔子提取物分離富集工藝進(jìn)行了研究，制備得到了總環(huán)烯醚萜有效部位和梔子苷制備物。通過對不同大孔吸附樹脂的篩選，確定A型大孔吸附樹脂對梔子總環(huán)烯醚萜和梔子苷具有良好的吸附分離性能。其分離富集的適宜工藝條件為：梔子A3％乙醇提取物用A樹脂分離富集，上樣液稀釋倍數(shù)為藥材的E1倍量，吸附流速為C1BV/h，樹脂柱徑高比為D2，上樣量與樹脂體積比為A

3、3，以B2倍樹脂體積的蒸餾水清洗樹脂柱，洗脫流速為F3BV/h?？偔h(huán)烯醚萜有效部位以W％乙醇洗脫cBV；梔子苷制備物以Q％乙醇洗脫，截取b～fBV洗脫液。最后對梔子各有效部位制備工藝進(jìn)行了驗(yàn)證。3批樣品的制備和含量測定結(jié)果表明梔子各有效部位制備工藝合理、穩(wěn)定。提取物得率24～26％，總環(huán)烯醚萜含量30％以上(32～33％)，梔子苷含量12％以上(12～13％)?？偔h(huán)烯醚萜有效部位得率9～10％，總環(huán)烯醚萜含量50％以上(51～53％)，

4、總環(huán)烯醚萜轉(zhuǎn)移率60％以上(60～63％)；梔子苷制備物得率7～8％，梔子苷含量67％以上(67～69％)。梔子苷的轉(zhuǎn)移率78％以上(78～82％)，基本穩(wěn)定且符合要求。 2建立了總環(huán)烯醚萜有效部位和梔子苷制備物中總環(huán)烯醚萜及主要指標(biāo)性成分梔子苷的定量方法。采用紫外－可見分光光度法對總環(huán)烯醚萜有效部位及藥材中的總環(huán)烯醚萜含量進(jìn)行測定?；貧w方程為Y=2.7297X-0.0098，r=0.9995(n=5)，表明梔子苷在0.042～

5、0.210mg范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，加樣回收率為101.83％，RSD=2.98％。測得總環(huán)烯醚萜有效部位中總環(huán)烯醚萜含量50％以上(51～53％)，藥材中總環(huán)烯醚萜含量為7.35％，RSD為2.83％；采用高效液相色譜法對梔子苷制備物及藥材中主要指標(biāo)性成分梔子苷含量進(jìn)行測定。回歸方程為Y=227378X-5702.8，r=0.9999(n=5)，表明梔子苷在0.432～2.160ug之間呈良好的線性關(guān)系，加樣回收率為102.

6、68％，RSD=2.59％。測得梔子有效部位中梔子苷含量67％以上(67～69％)，藥材中梔子苷含量為4.23％，RSD為0.90％。 第三部分連翹有效部位制備工藝及其質(zhì)量控制方法研究 1建立了連翹有效部位的制備方法。首先優(yōu)化了連翹有效部位的提取工藝，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以浸膏中總酚類苷和連翹苷提取率為評價(jià)指標(biāo)，對連翹有效部位提取工藝進(jìn)行考察，確定連翹有效部位的最佳提取工藝為：A2％乙醇回流提取B3次，每次C1h，溶劑用量

7、為D1倍。其次對連翹提取物分離富集工藝進(jìn)行了研究，通過對不同大孔吸附樹脂的篩選，確定A型大孔吸附樹脂對連翹中連翹酯苷和連翹苷具有良好的吸附分離性能。其分離富集連翹提取物的適宜工藝條件為：連翹A2％乙醇提取物用A樹脂分離富集，上樣液稀釋倍數(shù)為E1倍，吸附流速為C1BV/h，樹脂床直徑與高度比值約為D4，上樣量與樹脂體積比例為A3。以cBV的蒸餾水清洗樹脂柱后，先用bBVG％乙醇洗脫除雜，再用F％乙醇洗脫cBV，洗脫流速為F3BV/h。最后

8、對連翹有效部位制備工藝進(jìn)行了驗(yàn)證。3批樣品的制備和含量測定結(jié)果表明連翹有效部位制備工藝合理、穩(wěn)定。洗脫物得率4.6～4.8％，總酚類含量30％以上(30～32％)，連翹酯苷含量15％以上(15～16％)，連翹苷含量1.5％以上(1.5～1.6％)。連翹酯苷和連翹苷的洗脫率分別大于85％(86～90％)和95％(95～99％)，基本穩(wěn)定且符合要求。 2建立了連翹有效部位中總酚類及主要指標(biāo)性成分連翹酯苷和連翹苷的定量方法。采用紫外－

9、可見分光光度法對連翹有效部位中的總酚類含量進(jìn)行測定，以連翹酯苷為指標(biāo)性成分分析，回歸方程為Y=1.2572X+3E-6，r=0.9999(n=7)，表明連翹酯苷在0.022～0.22mg范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。加樣回收率為97.97％，RSD=1.42％。采用高效液相色譜法對連翹有效部位中主要指標(biāo)性成分連翹酯苷和連翹苷含量進(jìn)行測定。連翹酯苷回歸方程為Y=245399X+63339，r=0.9998(n=5)，表明連翹酯苷在0.1

10、515～1.01μg范圍內(nèi)與其色譜峰峰面積呈良好的線性關(guān)系，加樣回收率為100.79％，RSD為2.91％；連翹苷回歸方程為y=806271x-1157.2，r=0.9998(n=5)，表明連翹苷在0.24～1.2μg范圍內(nèi)與其色譜峰峰面積呈良好的線性關(guān)系。加樣回收率為99.00％，RSD為2.53％。 第四部分梔翹熱毒平方合提工藝及其質(zhì)量控制方法研究 1首次對梔翹熱毒平方合提工藝進(jìn)行了研究。采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以梔翹熱毒

11、平方中主要活性成分或指標(biāo)性成分梔子苷、連翹苷、牛蒡子苷、黃芩苷的提取率為評價(jià)指標(biāo)，對梔翹熱毒平方合提工藝進(jìn)行考察，確定梔翹熱毒平方合提最佳工藝為：A2％的乙醇回流提取B3次，每次C2h，溶劑用量為D2倍。同時(shí)對梔翹熱毒平方合提工藝進(jìn)行了驗(yàn)證。3批樣品的制備和含量測定結(jié)果表明梔翹熱毒平方合提工藝合理、穩(wěn)定。提取物得率28～29％，梔子苷含量5％以上(5～6％)，連翹苷含量0.1％以上(0.10～0.12％)，牛蒡子苷含量4.7％以上(4.

12、7～5.0％)，黃芩苷含量8％以上(8～8.5％)，基本穩(wěn)定且符合要求。 2首次建立了梔翹熱毒平方合提物中主要活性成分或指標(biāo)性成分梔子苷、連翹苷、牛蒡子苷、黃芩苷的高效液相色譜法定量方法。3批樣品及3批藥材中上述各成分的含量測定結(jié)果表明，建立的諸方法操作簡便，精密度和重復(fù)性良好，回收率合格，測定結(jié)果準(zhǔn)確，可作為梔翹熱毒平方合提物及其藥材質(zhì)量控制方法。 第五部分梔翹熱毒平方有效組分配伍質(zhì)量控制方法研究 本試驗(yàn)采用L

13、16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對梔翹熱毒平方有效組分進(jìn)行配伍。首次建立了梔翹熱毒平方有效組分配伍中主要活性成分或指標(biāo)性成分梔子苷、連翹苷、牛蒡子苷、黃芩苷的高效液相色譜法定量方法。對梔翹熱毒平方有效組分不同配伍的主要有效成分或指標(biāo)性成分進(jìn)行了含量測定。上述各成分的含量測定結(jié)果表明梔子苷、連翹苷、牛蒡子苷、黃芩苷分別在0.241～1.206μg、0.082～0.414μg、0.206～1.030μg、0.137～0.686μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好

14、，相關(guān)系數(shù)為0.9991～0.9999；回收率分別為101.88％、101.19％、101.98％、100.67％，滿足定量要求。建立的方法操作簡便，精密度和重復(fù)性良好，回收率合格，測定結(jié)果準(zhǔn)確，可作為梔翹熱毒平方有效組分配伍質(zhì)量控制方法。 首次建立了梔翹熱毒平方有效組分配伍不同波長(203nm和231nm)下的HPLC指紋圖譜，作為控制其質(zhì)量的定性指標(biāo)。通過對16個(gè)配伍樣品的色譜檢測和圖譜分析，確認(rèn)該指紋圖譜的主要技術(shù)參數(shù)為：

15、在203nm檢測波長下，有25個(gè)共有指紋峰(或峰組)；16個(gè)樣品中共有指紋峰相對保留時(shí)間的RSD為0.11％～2.18％。 通過對梔翹熱毒平方有效組分配伍HPLC指紋圖譜與處方相應(yīng)制備物指紋圖譜的相關(guān)性研究，闡明了梔翹熱毒平方有效組分配伍HPLC指紋圖譜共有指紋峰的來源。采用添加對照品指認(rèn)的方法對共有指紋峰進(jìn)行了化學(xué)成分的歸屬和確定。在203nm檢測波長下，確認(rèn)了4個(gè)色譜峰：峰1(梔子苷)、峰6(連翹酯苷)、峰15(連翹苷、黃芩